復方玄駒片微生物限度檢查的方法學驗證

(浙江省紹興市食品藥品檢驗所，浙江 紹興 312071)

復方玄駒片以螞蟻為主藥，佐以淫羊藿、枸杞子、蛇床子等藥，具有溫腎、壯陽、益精、祛風濕的功效，用于治療功能性陽痿、前列腺炎、男性不育及風濕等癥[1]。根據其用途、成分和制法，按2010年版《中國藥典(一部)》微生物限度檢查法[2]，應進行細菌數、霉菌及酵母菌數測定，并對控制菌－大腸埃希菌和沙門菌進行檢查?，F按規定建立微生物限度檢查方法，并加以驗證。

1 試驗材料

復方玄駒片(施強藥業集團有限公司，批號為20090101，20090102，20090103);營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基(BL)、營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、4－甲基傘形酮葡萄糠苷酸培養基(MUG)、四硫磺酸鈉亮綠基礎培養基(TTB)、膽鹽硫乳瓊脂培養基(DHL)、曙紅亞甲藍瓊脂培養基(EMB)均購自北京三藥科技開發公司;氯化鈉蛋白胨緩沖液(pH=7.0，杭州微生物試劑有限公司)。大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus aureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida aibicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B)50094]均購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及沙門菌取于35℃培養24 h的營養肉湯培養物，白色念珠菌取于25℃培養48 h的改良馬丁培養物，黑曲霉菌取于25℃培養7 d的改良馬丁瓊脂培養物，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL，洗下孢子置無菌試管中。以上菌懸液用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋法，稀釋至菌數約為50～100 cfu/mL，備用。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，加入pH為7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 mL，用磁力攪拌器攪拌使藥片溶解分散，作為1∶10的供試液。

2.3 回收率預試驗

為確定細菌、霉菌和酵母菌菌落數的測定方法，按照2010年版《中國藥典》規定的試驗菌株分別用常規法(0.5 mL/皿)、培養基稀釋法(0.2 mL/皿)對供試品進行預試驗。

常規法:取2.2項下制備的供試液1 mL和2.1項下制備的菌液1 mL，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，依法培養，進行菌落計數。結果，試驗組中大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、沙門菌、白色念珠菌及黑曲霉菌回收率均大于70%，達到2010年版《中國藥典》要求。金黃色葡萄球菌的回收率小于70%，采用培養基稀釋法對細菌計數作進一步預試驗。

培養基稀釋法:取供試液1 mL等量注入2個平皿，每個平皿注入0.5 mL，同時每個平皿注入金黃色葡萄球菌菌液1 mL，立即傾注營養瓊脂培養基，依法培養，進行菌落計數。結果金黃色葡萄球菌的回收率小于70%。采用每個平皿注入0.2 mL，用同種方法操作，結果金黃色葡萄球菌的回收率大于70%，加收率達到2010年版《中國藥典》要求。結果見表1?？梢?，供試品對金黃色葡萄球菌有抑制作用，用培養基稀釋法(0.2 mL/皿)可消除抑制作用，使回收率符合2010年版《中國藥典》要求。

表1 供試品對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.4 細菌、霉菌和酵母菌檢查方法驗證

取3個批號的供試品，按回收率預試驗結果，細菌計數采用培養基稀釋法(0.2 mL/皿)，霉菌和酵母菌采用常規法，每個批號分為4個組，對供試品作細菌、霉菌和酵母菌檢查方法驗證。結果見表2。

表2 供試品菌落數及回收率試驗結果(%)

2.5 控制菌檢查方法驗證[3]

試驗組:對于大腸埃希菌，取1∶10供試液10 mL及10～100 cfu/mL大腸埃希菌菌液加入膽鹽乳糖培養基100 mL中，依法培養，按相應的大腸埃希菌檢查方法檢查。對于沙門菌，取供試品10 g置200 mL的營養肉湯培養基中，加入10～100 cfu/mL乙型副傷寒沙門菌菌液，用磁力攪拌器攪拌，使藥片溶解分散，依法培養。按相應的沙門菌檢查方法檢查。結果見表3。

陰性對照組:取相應稀釋液替代供試液，不加試驗菌，檢查方法同試驗組。

表3 控制菌(大腸埃希菌、沙門菌)檢查結果

陽性對照組:取相應試驗菌菌液1 mL，不加供試液，檢查方法同試驗組。

可見在控制菌檢查中，試驗組的細菌生長良好，檢出試驗菌，陽性對照組檢出試驗菌，陰性對照組無菌生長，故供試品的控制菌檢查可采用常規法。

3 討論

復方玄駒片為口服制劑，根據預試驗結果，本品對金黃色葡萄球菌有抑制作用，文獻[4]處方中蛇床子有抑制金黃色葡萄球菌的作用，這與試驗結果基本一致。試驗顯示，采用培養基稀釋法(0.2 mL/皿)可消除金黃色葡萄球菌的抑制作用，使回收率大于70%。經驗證確定，細菌計數采用培養基稀釋法(0.2 mL/皿)，霉菌、酵母菌計數和控制菌檢查采用常規法，符合2010年版《中國藥典》微生物限度檢查方法的要求，可作為復方玄駒片的微生物限度檢查方法。

[1]WS3－014－2003(Z)－2008，國家食品藥品監督管理局國家藥品標準[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄ⅩⅢC，79.

[3]中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:351.

[4]高學敏.中藥學(供中醫藥專業用)[M].北京:中國中醫藥出版社，2002:597－598.