高效液相色譜法測定昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量

(廣西壯族自治區百色食品藥品檢驗所，廣西 百色 533000)

昆明山海棠 Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch.是衛矛科 Celastraceae雷公藤屬植物，所含生物堿類(包括雷公藤次堿、雷公藤春堿、雷公藤吉堿)、二萜類(主要成分是環氧二萜內酯化合物如雷公藤內酯、雷公藤內酯酮、雷公藤內酯醇、雷公藤甲素)、三萜類(雷公藤酯甲、雷公藤酯乙、山海棠內酯)及其他如β－谷甾醇葡萄糖苷、表兒茶素、對羥基苯甲酸等化學成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗生育等藥理活性，臨床常用于治療類風濕性關節炎、慢性腎炎、白血病、紅斑狼瘡等疾病[1]。昆明山海棠片為昆明山海棠經加工制成的薄膜衣片或糖衣片，收載于2010年版《中國藥典(一部)》，其質量標準采用回流提取測定總生物堿的含量[2]。近年來，采用高效液相色譜法測定昆明山海棠片中雷公藤甲素的含量已有報道[3]。本試驗中建立了高效液相色譜法測定昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量的方法，取得了良好的結果，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括G1322A在線脫氣、G1311A四元泵、G1314B VWD紫外檢測器、安捷倫化學工作站軟件;AND GR－202型電子天平。雷公藤酯甲對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為111597－200301);昆明山海棠片(市售，均為糖衣片);甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱:Phenomenex GeminiC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液－乙腈(32∶68);流速1.0mL/min;檢測波長:210 nm;柱溫:室溫;進樣量:10 μL。理論板數按雷公藤酯甲峰計應不低于3 000。雷公藤酯甲峰保留時間為25.7 min，陰性對照品溶液不干擾測定，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取雷公藤酯甲對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含50 μg的溶液，即得對照品溶液。取昆明山海棠片20片，除去包衣，研成細粉，精密稱取適量(相當于2.5片)，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲提取30 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得供試品溶液。根據處方和工藝，照供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察:精密稱取雷公藤酯甲對照品11.25 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含雷公藤酯甲 0.45 mg 的貯備液，精密量取貯備液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，分別進樣10 μL測定。以峰面積 A對質量濃度C(μg/mL)進行回歸處理，回歸方程為 A=3.461 1 C+0.900，r=0.999 7(n=5)。結果表明，雷公藤酯甲質量濃度在 18.0～90.0 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗:取質量濃度為54.0 μg/mL 的溶液，進樣 10 μL，連續進樣6次。結果雷公藤酯甲峰面積的 RSD為0.36%(n=6)，表明進樣精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品5份，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，在擬訂的色譜條件下進行分析測定。結果雷公藤酯甲含量平均值為0.6%，RSD=0.91%(n=5)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8 h 時進樣測定。結果雷公藤酯甲峰面積的 RSD為0.62%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

加樣回收試驗:精密稱定已測知含量的樣品(每片含雷公藤酯甲1.28 mg)粉末適量(相當于1片)，共6份，置50 mL量瓶中，分別精密加入含雷公藤酯甲對照品溶液(濃度為0.505 5 g/L)1.0，2.5，4.0 mL，按供試品溶液制備方法制備待測溶液并依法測定。按外標法以峰面積計算含量，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取昆明山海棠片20片，依法制備供試品溶液。取供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=4)

3 討論

曾比較了無水乙醇和甲醇對昆明山海棠片中雷公藤酯甲的提取效率，結果二者所得峰面積相近、峰形良好，但以乙醇作供試品溶劑時，進樣后會出現較大的前延峰，故采用甲醇提取。

超聲提取時間(15，30，60 min)的考察結果表明，用甲醇超聲提取30 min和60 min的含量相差不大，表明30 min超聲提取完全。因此，選擇以甲醇超聲提取樣品30 min。

昆明山海棠片的甲醇提取液呈棕紅色，所含成分較多，極性差別大，文獻[4]認為直接進樣會污染色譜柱，且分離效果差，故樣品預處理時都要過氧化鋁柱。本試驗參考文獻[5]，創新地將昆明山海棠片樣品以甲醇提取后直接測定，在雷公藤酯甲質量濃度為 18.0～90.0 μg/mL范圍內采用 C18色譜柱，控制適宜的流動相洗脫強度，可使雷公藤酯甲較好地與其他成分分離，避免了提取過程中的損失，達到了簡化操作的目的。

本試驗測定了3個廠家的4批產品，結果表明，不同廠家生產的昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量為0.78～1.28 mg，這可能是由所用的昆明山海棠藥材產地、采收期及生產工藝的差異造成。本法具有簡便快速、重現性好的優點，可用于昆明山海棠片的質量控制。

[1]王 鉞，隆長鋒.中藥昆明山海棠的研究進展[J].醫學綜述，2006，12(11):691－692.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:812－813.

[3]李勝容，王賢英.HPLC法測定昆明山海棠片中雷公藤甲素的含量[J].藥物分析雜志，2008，28(7):1 150－1 152.

[4]陳曉明.高效液相色譜法測定雷公藤飲片中雷公藤內酯醇的含量[J].中國藥房，2006，17(9):696－697.

[5]黃秀旺，許建華，陳元仲.高效液相色譜法測定雷公藤片中雷公藤甲素含量的方法改進[J].海峽藥學，2009，21(12):57－58.