呋塞米注射液細菌內毒素檢查法的建立

(河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450003)

呋塞米注射液為利尿藥，在2005年版《中國藥典(二部)》收載的質量標準中無熱原檢查項。為了加強質量控制，筆者對呋塞米注射液中細菌內毒素檢查法的可行性進行了研究。

1 儀器與試藥

DC－3A型干式恒溫器(南京三愛斯技術開發有限公司)。呋塞米注射液(山西晉新雙鶴藥業有限責任公司，規格為2 mL∶20 mg，批號為200907131;天津金耀氨基酸有限公司，規格為2 mL∶20 mg，批號為0907162;陜西京西藥業有限公司，規格為2 mL∶20 mg，批號為0904201;鄭州羚銳制藥股份有限公司，規格為2 mL∶20 mg，批號為0906281);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，規格為0.5 mL，批號分別為 0902132，0710262，靈敏度分別為 0.125，0.5 EU/mL;福州新北生化工業有限公司，規格為0.5 mL，批號為08020912，靈敏度為0.5 EU/mL;湛江博康海洋生物有限公司，規格為 0.5 mL，批號為 0901122，靈敏度為 0.125 EU/mL);細菌內毒素工作標準品(以下簡稱WSE，中國藥品生物制品檢定所，效價為120 EU/支，批號為150601－200862);細菌內毒素檢查用水(以下簡稱BET用水，中國藥品生物制品檢定所，規格為10 mL，批號為W2008－4)。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑標示靈敏度(λ)的復核

依法[1]對試驗用鱟試劑進行靈敏度復核。結果4批鱟試劑靈敏度測試值(λc)均在0.5～ 2.0 λ之間，表明鱟試劑靈敏度符合規定，可用于試驗。

2.2 樣品內毒素限值(L)的確定

按照2005年版《中國藥典(二部)》相關方法[1]，根據公式L=K/M，[K為每人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑 K=5 EU/(kg×h);M為每人每公斤體重每小時的最大供試品劑量]，參照該藥品說明書及《臨床用藥須知》[1－2]，滴注速度每分鐘不超過 4 mg，得 M=4.0 mg(kg×h)，則 L=1.2 EU/mg。

2.3 樣品預干擾試驗

由于所用鱟試劑的靈敏度(λ)為0.5 EU/mL，則樣品的最大有效稀釋倍數(MVD)=CL/λ=24(倍)，采用不超過最大有效稀釋倍數即 3，6，12，24 倍的溶液(質量濃度分別為 3.3，1.7，0.8，0.4 g/L)作為供試品陰性對照(NPC)管，根據使用鱟試劑的靈敏度，在其中分別添加2 λ的細菌內毒素，制成供試品陽性對照(PPC)管，用 λ=0.5 EU/mL的鱟試劑，分別與4個系列溶液反應，各重復2管，同時作陰性對照(NC)和陽性對照(PC)各2管，做2個批號樣品預干擾試驗[1，3]，結果見表1。可見，呋塞米注射液稀釋至0.8 g/L時，不再對試驗產生干擾。

表1 干擾預試驗結果

2.4 供試品正式干擾試驗

使用鱟試劑，將呋塞米注射液稀釋12倍(0.8 g/L)，進行正式干擾試驗[1，3]。結果見表 2。可見，4 批樣品的 12 倍稀釋液(0.8 g/L)對兩個廠家的鱟試劑干擾試驗，結果內毒素標準品水溶液反應終點濃度的幾何平均值(Es)為 0.5 ～2.0 λ(包括 0.5 λ 和 2.0 λ)，內毒素供試品溶液反應終點濃度的幾何平均值(Et)為0.5～2.0 Es(包括 0.5 Es和 2.0 Es)，說明該樣品稀釋 12 倍后確已排除干擾作用。

2.5 樣品細菌內毒素檢查

取4個批號樣品，用BET用水分別溶解稀釋制成0.8 g/L溶液，用鱟試劑 λ為0.125 EU/mL，按檢查法進行操作和結果判斷，以 L為1.2 EU/mg作為評定標準，結果見表3。可見，4個批號的呋塞米注射液采用兩個廠家生產的鱟試劑作細菌內毒素檢查[1，4]，結果均小于限值(1.2 EU/mg)。

表2 干擾試驗結果

3 討論

呋塞米注射液工藝處方中使用的輔料有氫氧化鈉、氯化鈉、亞硫酸鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、依地酸二鈉等，不同生產企業的輔料使用情況存在差異。本試驗充分考慮到了這種差異，選取了有代表性的4個廠家的呋塞米注射液，基本排除了不同處方工藝的影響。

由預干擾試驗和正式干擾試驗結果可知，呋塞米注射液在稀釋至0.8 g/L及以下濃度與靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑反應無干擾影響，本品可以采用細菌內毒素檢查法進行質量控制，其細菌內毒素檢查項可擬訂為“每1 mg呋塞米中含內毒素的量應小于 1.2 EU”。

表3 樣品的細菌內毒素檢查結果

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業出版社，2005:附錄ⅪE.

[2]國家藥典委員會.臨床用藥須知(化學藥和生物制品卷)[M].北京:化學工業出版社，2005:329.

[3]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社，2005:287.

[4]張廣偉，周繼春.尼可剎米注射液細菌內毒素檢查法的建立[J].中國藥業，2010，19(6):32－33.