呋塞米注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003)

呋塞米注射液為利尿藥，在2005年版《中國(guó)藥典(二部)》收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)熱原檢查項(xiàng)。為了加強(qiáng)質(zhì)量控制，筆者對(duì)呋塞米注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

DC－3A型干式恒溫器(南京三愛(ài)斯技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。呋塞米注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格為2 mL∶20 mg，批號(hào)為200907131;天津金耀氨基酸有限公司，規(guī)格為2 mL∶20 mg，批號(hào)為0907162;陜西京西藥業(yè)有限公司，規(guī)格為2 mL∶20 mg，批號(hào)為0904201;鄭州羚銳制藥股份有限公司，規(guī)格為2 mL∶20 mg，批號(hào)為0906281);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格為0.5 mL，批號(hào)分別為 0902132，0710262，靈敏度分別為 0.125，0.5 EU/mL;福州新北生化工業(yè)有限公司，規(guī)格為0.5 mL，批號(hào)為08020912，靈敏度為0.5 EU/mL;湛江博康海洋生物有限公司，規(guī)格為 0.5 mL，批號(hào)為 0901122，靈敏度為 0.125 EU/mL);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(以下簡(jiǎn)稱(chēng)WSE，中國(guó)藥品生物制品檢定所，效價(jià)為120 EU/支，批號(hào)為150601－200862);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(以下簡(jiǎn)稱(chēng)BET用水，中國(guó)藥品生物制品檢定所，規(guī)格為10 mL，批號(hào)為W2008－4)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑標(biāo)示靈敏度(λ)的復(fù)核

依法[1]對(duì)試驗(yàn)用鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核。結(jié)果4批鱟試劑靈敏度測(cè)試值(λc)均在0.5～ 2.0 λ之間，表明鱟試劑靈敏度符合規(guī)定，可用于試驗(yàn)。

2.2 樣品內(nèi)毒素限值(L)的確定

按照2005年版《中國(guó)藥典(二部)》相關(guān)方法[1]，根據(jù)公式L=K/M，[K為每人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑 K=5 EU/(kg×h);M為每人每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量]，參照該藥品說(shuō)明書(shū)及《臨床用藥須知》[1－2]，滴注速度每分鐘不超過(guò) 4 mg，得 M=4.0 mg(kg×h)，則 L=1.2 EU/mg。

2.3 樣品預(yù)干擾試驗(yàn)

由于所用鱟試劑的靈敏度(λ)為0.5 EU/mL，則樣品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)=CL/λ=24(倍)，采用不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)即 3，6，12，24 倍的溶液(質(zhì)量濃度分別為 3.3，1.7，0.8，0.4 g/L)作為供試品陰性對(duì)照(NPC)管，根據(jù)使用鱟試劑的靈敏度，在其中分別添加2 λ的細(xì)菌內(nèi)毒素，制成供試品陽(yáng)性對(duì)照(PPC)管，用 λ=0.5 EU/mL的鱟試劑，分別與4個(gè)系列溶液反應(yīng)，各重復(fù)2管，同時(shí)作陰性對(duì)照(NC)和陽(yáng)性對(duì)照(PC)各2管，做2個(gè)批號(hào)樣品預(yù)干擾試驗(yàn)[1，3]，結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，呋塞米注射液稀釋至0.8 g/L時(shí)，不再對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生干擾。

表1 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.4 供試品正式干擾試驗(yàn)

使用鱟試劑，將呋塞米注射液稀釋12倍(0.8 g/L)，進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)[1，3]。結(jié)果見(jiàn)表 2。可見(jiàn)，4 批樣品的 12 倍稀釋液(0.8 g/L)對(duì)兩個(gè)廠家的鱟試劑干擾試驗(yàn)，結(jié)果內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es)為 0.5 ～2.0 λ(包括 0.5 λ 和 2.0 λ)，內(nèi)毒素供試品溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Et)為0.5～2.0 Es(包括 0.5 Es和 2.0 Es)，說(shuō)明該樣品稀釋 12 倍后確已排除干擾作用。

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取4個(gè)批號(hào)樣品，用BET用水分別溶解稀釋制成0.8 g/L溶液，用鱟試劑 λ為0.125 EU/mL，按檢查法進(jìn)行操作和結(jié)果判斷，以 L為1.2 EU/mg作為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，4個(gè)批號(hào)的呋塞米注射液采用兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[1，4]，結(jié)果均小于限值(1.2 EU/mg)。

表2 干擾試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

呋塞米注射液工藝處方中使用的輔料有氫氧化鈉、氯化鈉、亞硫酸鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、依地酸二鈉等，不同生產(chǎn)企業(yè)的輔料使用情況存在差異。本試驗(yàn)充分考慮到了這種差異，選取了有代表性的4個(gè)廠家的呋塞米注射液，基本排除了不同處方工藝的影響。

由預(yù)干擾試驗(yàn)和正式干擾試驗(yàn)結(jié)果可知，呋塞米注射液在稀釋至0.8 g/L及以下濃度與靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑反應(yīng)無(wú)干擾影響，本品可以采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行質(zhì)量控制，其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)可擬訂為“每1 mg呋塞米中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于 1.2 EU”。

表3 樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄ⅪE.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).臨床用藥須知(化學(xué)藥和生物制品卷)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:329.

[3]中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005:287.

[4]張廣偉，周繼春.尼可剎米注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，19(6):32－33.