高效凈化污水光合細(xì)菌的分離鑒定

馬姝萍 趙述淼 郭俊平 葛向陽

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

光合細(xì)菌（Photosynthetic bacteria）簡(jiǎn)稱 PSB，廣泛存在于自然界的江河、湖泊、海洋、土壤及活性污泥內(nèi)。它們具有原始的光能合成體系，以光為能源，能在好氧黑暗或厭氧光照條件下進(jìn)行光合作用，而作為供氫體和碳源的是自然界的有機(jī)物、硫化物、氨等，這就使得光合細(xì)菌在自然界的氮、碳、硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值。也正是由于PSB的這一生理特性，使得其作為水質(zhì)凈化劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖和污水凈化中顯示出強(qiáng)有力的優(yōu)勢(shì)。

本研究主要是通過比較不同來源的光合細(xì)菌對(duì)實(shí)際污染水樣的處理情況，選擇一株具有高效凈水效果的菌株，并探討將其用于生產(chǎn)實(shí)踐的可能性。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院發(fā)酵工程室提供沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）等3株光合細(xì)菌；其它來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)青年湖及食堂污水池。

1.2 培養(yǎng)基及其他試劑

富集培養(yǎng)基：NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NH4Cl 1 g、NaHCO32 g、KH2PO41.75 g、CH3COONa 3 g、酵母粉 1 g，蒸餾水 1000 ml，pH 值 7.0。

分離培養(yǎng)基：添加1%瓊脂粉的富集培養(yǎng)基。

T載體試劑盒與引物：均由上海英俊基因技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

波長(zhǎng)掃描使用美國Beckman紫外可見分光光度計(jì)DU800。

1.3 菌株的分離與篩選

1.3.1 富集

取1 ml污水樣本裝入已有500 ml富集培養(yǎng)基的鹽水瓶中，30℃，60 W白熾燈光照培養(yǎng)7～8 d。待培養(yǎng)液變成紅色，吸出紅色液體5 ml，連續(xù)富集3次。

1.3.2 分離純化

采用稀釋瓊脂管與雙層平板相結(jié)合的方法。取富集液稀釋至105倍,吸取0.1 ml加入冷卻至45～55℃分離培養(yǎng)基的螺口試管中，30℃，光照培養(yǎng)4～5 d后，挑取紅色單菌落,平板劃線后鋪上一層已冷卻至40℃的0.8%瓊脂液，30℃光照培養(yǎng)3～4 d，再挑取紅色單菌落如此反復(fù)2～3次，直至在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)一致，純化結(jié)束。

1.4 分離菌株對(duì)污水處理

取華中農(nóng)業(yè)大學(xué)青年湖中水樣分裝于500 ml鹽水瓶中,立即滅菌(121℃，30 min),待冷卻至室溫后分別接入0.04%的光合細(xì)菌培養(yǎng)液(菌數(shù)為1.7×109個(gè)/ml),無菌操作取200 ml待測(cè)水質(zhì)指標(biāo),30℃,光照培養(yǎng)4 d后取200 ml待測(cè)水質(zhì)指標(biāo)。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 16S rDNA序列分析

引物:上游引物 27F：5-agagtttgatcctggctcag-3;下游引物 1492R：5-ggttaccttgttacgactt-3；擴(kuò)增體系(50 μl):27F 1 μl，1492R 1 μl，ddH2O 23 μl，MasterMix 25 μl，單菌落。擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；50 ℃，45 s；72 ℃，2 min；72 ℃，10 min；32個(gè)循環(huán)；4 ℃，10 min。

1.5.2 T-載體克隆

純化的PCR產(chǎn)物與PCR 2.1載體連接并轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α受體菌，在氨芐青霉素（Amp）篩選平板上挑選克隆子，接于含有Amp的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。取1 ml培養(yǎng)物用于質(zhì)粒抽提，使用EcoR I酶酶切，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠，電泳，選擇5500 bp條帶相對(duì)應(yīng)的菌進(jìn)行測(cè)序。

1.5.3 生理生化鑒定

該菌株的生理生化特性鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行，主要有運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、H2S生成試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和唯一碳源試驗(yàn)。

1.6 藥敏試驗(yàn)

取打孔濾紙片，浸泡在不同抗生素中，稀釋菌液1000倍,涂布,待菌液干后,將濾紙片貼在其表面,30℃光照培養(yǎng)5 d，測(cè)量抑菌圈直徑。以浸泡滅菌蒸餾水的濾紙為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

通過對(duì)不同樣品反復(fù)分離純化，得到7株菌，命名為 P1、P2、P3(實(shí)驗(yàn)室提供沼澤紅假單胞菌)、P4、P5、P6、P7，這幾株菌菌落形態(tài)較一致，在瓊脂管里菌落呈深紅色，圓餅狀，直徑為0.4～1.0 mm。邊緣光滑，稍突起，不透明。顯微鏡觀察，P1菌和P3菌呈短桿狀，P2、P4、P5、P6、P7 菌呈球狀。

2.2 分離菌株對(duì)污水處理效果

2.2.1 分離菌株對(duì)水體CODMn的去除效果

水體CODMn值是指利用化學(xué)氧化劑高錳酸鉀將水中可氧化物質(zhì)（如有機(jī)物、亞硝酸鹽、亞鐵鹽、硫化物等）氧化分解，然后根據(jù)殘留的氧化劑的量計(jì)算出氧的消耗量，是表示水質(zhì)污染度的重要指標(biāo)。當(dāng)水體的CODMn值過高，水體變成還原性，導(dǎo)致水生生物死亡，它們的尸體被厭氧菌不完全氧化，產(chǎn)生有機(jī)毒物，如尸體中的硫元素會(huì)轉(zhuǎn)變成硫化氫，氮元素會(huì)變成甲胺等，這些物質(zhì)不但奇臭無比而且有很強(qiáng)生物毒性，影響水體質(zhì)量。

取滅菌污水樣品，分別投入分離得到的7株菌并檢測(cè)它們對(duì)水體CODMn的去除效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 7株光合細(xì)菌對(duì)青年湖水CODMn的去除效果

從圖1可知，這7株菌對(duì)水體有機(jī)質(zhì)均有一定的吸收能力，其中P1、P3、P4能力較強(qiáng)，CODMn的去除率分別達(dá)到了66.87%、52.31%、46.93%，而其它菌對(duì)CODMn的去除效果不明顯，均未超過30%。由于不同菌株的生理活性有所差異，它們的培養(yǎng)液中有機(jī)質(zhì)含量可能會(huì)不同，導(dǎo)致各個(gè)樣品的CODMn起始值也有差異。總的來說，P1菌對(duì)水體有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化能力很強(qiáng)，能有效降低水體有機(jī)質(zhì)含量，達(dá)到凈化水體的作用。

2.2.2 分離菌株對(duì)水體氨態(tài)氮的去除效果

水體氨態(tài)氮含量過高會(huì)引起藻類及其他浮游生物迅速繁殖，水體溶解氧下降，水質(zhì)惡化，魚類及其他生物大量死亡，導(dǎo)致水體的富營養(yǎng)化。人畜長(zhǎng)期飲用這樣的水，會(huì)中毒致病。

取滅菌污水樣品，分別投入分離得到的7株菌并檢測(cè)它們對(duì)水體氨態(tài)氮的去除效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 7株光合細(xì)菌對(duì)青年湖水氨態(tài)氮的去除效果

由圖 2 分析可知，P1、P3、P4、P5、P7 對(duì)水體氨態(tài)氮有一定的降低作用，其中P1菌的效果相對(duì)于其他菌的效果最好，達(dá)到3.33%；P3菌對(duì)氨態(tài)氮的去除率僅為1.52%，低于P1菌。P2、P6菌不但對(duì)氨態(tài)氮沒有降低作用，反而提高了水體的氨含量，可能是這兩株菌對(duì)氨態(tài)氮的吸收轉(zhuǎn)化活性沒有其他菌強(qiáng)。總之，P1菌相對(duì)于其他菌對(duì)水體氨態(tài)氮的吸收轉(zhuǎn)化能力較好，對(duì)降低水體氨態(tài)氮有一定效果。

2.2.3 分離菌株對(duì)污水磷的去除效果

水體的磷含量過高也是水體富營養(yǎng)化的原因之一。水體中過量的磷一方面來自工業(yè)廢水和生活污水，另一方面，水體中的底泥在還原狀態(tài)下也會(huì)釋放磷酸鹽。如果不對(duì)水體過量的磷進(jìn)行處理，會(huì)造成水體的惡性循環(huán)。

取滅菌污水樣品，分別投入分離得到的7株菌并檢測(cè)它們對(duì)水體磷的去除效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

這7株菌對(duì)水體磷均有一定的去除效果，其中P1菌和P4菌的除磷效果好于其他5株菌，去除率分別為8.03%和9.37%，P3菌的去除效果最差，去除率僅為0.48%。由此可知，P1菌和P4菌對(duì)水體磷的降低有一定作用。

圖3 7株光合細(xì)菌對(duì)青年湖水磷的去除效果

通過對(duì)以上7株菌處理污水能力的比較，發(fā)現(xiàn)P1菌對(duì)污水體的CODMn、氨態(tài)氮含量、磷含量都有明顯的降低作用,能夠分別達(dá)到66.87%、3.33%和8.03%。表明P1菌凈化水質(zhì)的綜合能力較強(qiáng)，確定其為本研究的目的菌株。

2.3 P1菌菌種鑒定

2.3.1 測(cè)序結(jié)果及序列分析

將相對(duì)應(yīng)的陽性轉(zhuǎn)化子送至上海英俊基因技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,序列結(jié)果顯示目的基因?yàn)?568 bp,接近16S rDNA基因片段的長(zhǎng)度。用NCBI-Blast軟件將測(cè)序結(jié)果在GenBank等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索。在GeneBank上登錄結(jié)果顯示P1菌的16S rDNA序列與Rhodopseudomonas faecalis(糞紅假單胞菌)16S rDNA序列的同源性較高，相似性達(dá)到99%。

2.3.2 P1菌生理生化特征

2.3.2.1 形態(tài)特征

本菌株為革蘭氏染色陰性，短桿狀，二分分裂繁殖，運(yùn)動(dòng)活躍，菌落呈深紅色，圓餅狀，直徑1.0 mm左右，表面微凸，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)。

2.3.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

P1菌的生理生化特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 P1菌生理生化特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》以及16S rDNA的測(cè)序結(jié)果，P1菌即為糞紅假單胞菌（R.faecalis）。

2.4 P1菌活細(xì)胞吸收光譜

P1菌株活細(xì)胞經(jīng)過波長(zhǎng)300～800 nm范圍內(nèi)連續(xù)掃描結(jié)果見圖4。在300～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有3個(gè)特征吸收峰，分別位于370、480、590 nm處。在370 nm和590 nm處有吸收峰，說明活細(xì)胞中存在細(xì)菌葉綠素a；在480 nm處有吸收峰說明活細(xì)胞中含有類胡羅卜素。光合細(xì)菌的吸收光譜主要受葉綠素a和類胡蘿卜素成分的影響。

圖4 光合細(xì)菌P1吸收光譜

2.5 抗生素對(duì)P1菌的影響

光合細(xì)菌菌劑多用于養(yǎng)殖水體，而養(yǎng)殖水體中多含有添加抗生素的餌料，故需要考慮光合細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 P1菌對(duì)各種常用抗生素的敏感性（x±s，n=3）

從表2分析可以看出，P1菌對(duì)以上7種常用抗生素均有一定的敏感性,其中對(duì)慶大霉素最敏感,抑菌圈直徑超過1.5 cm,其次是氨芐青霉素和鏈霉素,抑菌圈接近1.0 cm，最不敏感的是卡那霉素，不足0.7 cm。該結(jié)果表明在使用P1菌凈化養(yǎng)殖水體時(shí)，需要注意餌料中抗生素對(duì)其的影響，及時(shí)補(bǔ)充P1菌的投放量，確保其在水體微生物中的優(yōu)勢(shì)地位以保證凈化水質(zhì)效果。

3 討論

近20年來，對(duì)光合細(xì)菌的應(yīng)用研究獲得了很大的進(jìn)展，但是也出現(xiàn)過不少問題，如菌種純化問題。在本研究中采用稀釋瓊脂管法和雙層平板法結(jié)合分離純化光合細(xì)菌可以彌補(bǔ)因?yàn)殚L(zhǎng)期厭氧光照培養(yǎng)導(dǎo)致固體培養(yǎng)基滲水干枯的缺點(diǎn)，強(qiáng)化分離純化效果。而采用T載體克隆的方法進(jìn)行光合細(xì)菌16S rDNA測(cè)序,可以避免雜菌DNA對(duì)目的菌的影響,大大提高DNA測(cè)序效率。

參照水質(zhì)監(jiān)測(cè)國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)菌株進(jìn)行凈水能力的檢測(cè)，結(jié)果顯示分離菌株對(duì)水體的有機(jī)質(zhì)、氨態(tài)氮和磷有一定的去除作用，但各個(gè)菌去除效果不同，可能是因?yàn)椴煌暝诓煌鬯猩砘钚圆煌瑢?dǎo)致其對(duì)水質(zhì)凈化效果有一定差異，尚待進(jìn)一步研究。

本研究從篩選分離出的7株光合細(xì)菌為出發(fā)，挑選出一株光合細(xì)菌P1，經(jīng)鑒定，該菌為糞紅假單胞菌（R.faecalis），其對(duì)污水有機(jī)質(zhì)的去除率達(dá)到了66.87%，說明該菌能高效吸收污水中的有機(jī)質(zhì)，對(duì)氨態(tài)氮和磷的去除也有一定的效果，但去除率均不高，分別為3.33%和8.03%。此外，本研究中的沼澤紅假單胞菌(R.palustris)對(duì)上述指標(biāo)的去除率分別為52.31%、1.52%和0.48%。由此可見，糞紅假單胞菌各項(xiàng)指標(biāo)均高于沼澤紅假單胞菌。同時(shí)對(duì)該菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)常用抗生素均有一定的敏感性，使用該菌凈化養(yǎng)殖水體時(shí)需要及時(shí)投放光合細(xì)菌以保證凈化效果。

4 結(jié)語

隨著工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，水體的污染越來越嚴(yán)重。采用微生物法治理污水，使用方便，投資少、收效快。在水中自然生長(zhǎng)、繁殖、再建微生物生態(tài)平衡的同時(shí)提高水體的自凈能力。雖然糞紅假單胞菌尚未列入飼用微生物制劑行列，關(guān)于其凈化水質(zhì)能力也鮮有報(bào)道，但該菌對(duì)水體有機(jī)質(zhì)較強(qiáng)的吸收能力必將引起極大的關(guān)注，今后在微生物治理污水中有著廣泛的應(yīng)用前景。

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