靶向HER2基因的siRNA聯合卡鉑對肺腺癌A549細胞的抑制作用

曹新梅，張岱權，王 栩，任德蓮，劉代玉

(1瀘州醫學院，四川瀘州646000;2瀘州醫學院附屬醫院)

HER2基因是一種具有酪氨酸激酶活性的膜表面受體。該受體數量、結構的異常變化常可導致細胞生長異常及癌腫的形成。有文獻報道［1］，1/3以上的非小細胞肺癌存在HER2蛋白過度表達。2010年7月～2011年12月，我們觀察了靶向HER2基因的siRNA聯合卡鉑對肺腺癌A549細胞的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細胞株(由瀘州醫學院免疫學實驗室提供)。RPMI 1640(美國Invitrogen公司)、小牛血清(天津海洋生物)。焦碳酸二乙酯(DEPC)(美國Sigma公司)，LIPOFECTAMINE 2000 Reagent、Trizol(美國Invitrogen公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(日本TOYOBO公司)，卡鉑(齊魯制藥有限公司)，SABC免疫組化試劑盒(丹麥DAKO公司)，AnnexinⅤ-FITC Kit凋亡試劑盒(凱基公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌A549細胞培養及分組 肺腺癌A549細胞株常規培養于含10%小牛血清的RPMI 1640培養基。取對數生長期肺腺癌A549細胞制備成細胞懸液，接種于6孔板。當細胞融合40% ～60%時，分為6組進行轉染:2621組、1724組、1491組(數字為合成3對HER2 siRNA的代碼)、陰性對照組、GAPDH陽性對照組和空白組，每組3個復孔。以LIPOFECTAMINE 2000 Reagent為轉染試劑，按照說明書進行siRNA轉染。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測HER2 mRNA水平 轉染24 h后，用Trizol試劑抽提每組細胞的總RNA，逆轉錄，按照試劑盒說明行實時熒光定量PCR。反應條件:95℃預變性10 s，95℃變性10 s，60℃退火15 s，40個循環。運用 MyiQTMOptical Module的電腦軟件分析系統對實時熒光定量PCR反應結果進行分析。

1.2.3 免疫組化檢測肺腺癌A549細胞HER2蛋白表達水平 將經多聚賴氨酸包被處理過的玻片放入6孔板中，接種肺腺癌A549細胞，進行轉染。轉染48 h后，取出玻片，用PBS沖洗2次，在中性甲醛中固定，SABC常規免疫組化方法檢測HER2蛋白的表達水平。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 實驗分組:①空白組;②陰性siRNA組;③陰性siRNA+卡鉑(40或60 mg/L)組;④2621組;⑤2621+卡鉑(40或60 mg/L)組;⑥1724組;⑦1724+卡鉑(40或60 mg/ L)組;⑧卡鉑(40或60 mg/L)組。收集每組細胞，PBS洗滌細胞2次，加入Binding Buffer 500 μL重懸細胞;置入5 μL AnnexinⅤ-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻;室溫、避光反應10 min，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件，計量資料以s表示，多樣本均數兩兩比較采用q檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HER2 mRNA及蛋白水平比較 見表1。

表1 各組HER2 mRNA及蛋白水平比較(s)

表1 各組HER2 mRNA及蛋白水平比較(s)

注:與2621組、1724組比較，*P＜0.05

蛋白2621組組別 n HER2 mRNA HER2 3 1.00±0.00 9.93±2.03 1724組 3 1.48±0.23 12.72±1.34 1491組 3 5.79±3.52* 16.59±2.44*陰性對照組 3 8.30±0.23* 20.62±0.52*空白組 3 － 20.07±1.80*

2.2 各組細胞的凋亡率比較 各組細胞的凋亡率的差異性有統計學意義(F=373.74，P＜0.01)，HER2 siRNA+卡鉑組細胞的凋亡率均高于對應濃度的卡鉑組。見表2。

3 討論

卡鉑是第2代鉑類化療藥，在治療肺癌方面有較好療效，能提高腫瘤控制率和患者生存率。但其毒副作用可嚴重影響患者的生存狀況和遠期療效。

RNAi可應用特異的siRNA有效抑制內源性基因的表達。由于RNAi具有高效、特異、快速、毒副作用小等優點，且能在轉錄后水平顯著抑制腫瘤相關基因的表達，因而可望成為腫瘤基因治療的有效手段。本實驗共設計3對HER2 siRNA轉染HER2基因高表達的肺腺癌A549細胞，結果顯示，2621和1724組能抑制該基因的表達，與申萍等［2］的研究結果相似。

表2 各組肺腺癌A549細胞的凋亡率比較(s)

注:與陰性siRNA+卡鉑60 mg/L組、1724+卡鉑60 mg/L組、卡鉑60 mg/L組、2621+卡鉑40 mg/L組、2621組、陰性siRNA組、空白組比較，▲P＜0.05;與陰性siRNA+卡鉑40 mg/L組、卡鉑40 mg/ L組比較，★P＜0.05;與1724+卡鉑40 mg/L組、1724組、陰性siRNA組、空白組比較，◆P＜0.05;與陰性siRNA+卡鉑40 mg/L組、陰性siRNA組、空白組比較，■P＜0.05;與卡鉑40 mg/L組、空白組比較，●P＜0.05

組別 n 凋亡率(%) 10.23±0.36陰性siRNA組 3 9.68±0.39陰性siRNA+卡鉑40 mg/L組 3 15.75±0.05陰性siRNA+卡鉑60 mg/L組 3 17.77±0.11■2621組 3 11.33±0.21 2621+卡鉑40 mg/L組 3 17.51±0.16★2621+卡鉑60 mg/L組 3 20.26±0.55▲1724組 3 11.17±0.15 1724+卡鉑40 mg/L組 3 17.41±0.71★1724+卡鉑60 mg/L組 3 18.41±0.28◆卡鉑40 mg/L組 3 15.30±0.10卡鉑60 mg/L組 3 17.93±0.06空白組3●

國內外研究發現，HER2基因高表達與非小細胞肺癌對順鉑、環磷酰胺、6氟尿嘧啶以及阿霉素的耐藥性顯著相關［3］。Valero等［4］研究發現，抗HER2的單克隆抗體與卡鉑、多西他賽聯用，治療HER2基因擴增的轉移性乳腺癌有效。本實驗研究結果顯示，聯合應用siRNA和卡鉑組細胞的凋亡率均高于對應濃度的卡鉑組。

綜上所述，HER2 siRNA與卡鉑具有協同作用，能夠促進A549細胞凋亡，為臨床探討肺腺癌治療的新途徑奠定實驗基礎。

［1］馮元賢，顧偉勇.C-erbB-2基因產物在耐藥非小細胞肺癌的表達［J］.蘇州醫學院學報，1998，18(6):557-558.

［2］申萍，張方，吳學玲，等.RNA干擾her2/neu基因表達抑制肺癌A549細胞增殖的研究［J］.醫學研究生學報，2009，22(3):236-239，243.

［3］王煜霞，姬明麗，李生瑩，等.c-erbB-2的表達與非小細胞肺癌多藥耐藥的關系［J］.新鄉醫學院學報，2006，23(5):469-472.

［4］Valero V，Forbes J，Pegram MD，et al.Multicenter phaseⅢrandomized trial comparing docetaxel and trastuzumab with docetaxel，carboplatin，and trastuzumab as first-line chemotherapy for patients with HER2-gene-amplified metastatic breast cancer(BCIRG 007 study):two highly active therapeutic regimens［J］.J Clin Oncol，2011，29(2):149-156.