新牧1號(hào)苜蓿兩個(gè)抗逆相關(guān)基因啟動(dòng)子的克隆及分析

楊云堯，任燕萍，蘇豫梅，陳全家，張 博，張 樺

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2．新疆草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

從抗逆性較強(qiáng)的新牧1號(hào)苜蓿(MedicagovariaXinmu-1)中成功克隆得到了兩個(gè)抗逆相關(guān)基因MvNHX1(NCBI登錄號(hào)：EU375310)和MvDREB1(NCBI登錄號(hào)：GU073286)。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成基因(NHX)會(huì)在外界環(huán)境的Na+濃度提高時(shí)，合成Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，然后將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，實(shí)現(xiàn)區(qū)隔化，從而減少細(xì)胞質(zhì)中的Na+濃度[1-2]；DREB1蛋白是植物體內(nèi)一種非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可誘導(dǎo)一系列非生物逆境相關(guān)基因表達(dá)，研究表明，轉(zhuǎn)DREB1基因可以改良轉(zhuǎn)基因植株逆境耐受性[3-4]。但是，在植物基因工程中，外源基因上游大量使用的是組成型啟動(dòng)子，如CaMV35S啟動(dòng)子，組成型啟動(dòng)子調(diào)控的下游基因表達(dá)沒(méi)有時(shí)空的特異性，在植物的任何生長(zhǎng)發(fā)育階段和組織中都正常表達(dá)，這會(huì)造成細(xì)胞代謝負(fù)荷而影響植物的長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量。目前，因?yàn)橐恍┱T導(dǎo)型啟動(dòng)子可以有效地調(diào)控下游基因的表達(dá)，如rd29A啟動(dòng)子，所以能夠更好地降低轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)積累的外源蛋白對(duì)其自身造成的傷害。Kasuga等[5]將rd29A：：DREB1A和35S：：DREB1A轉(zhuǎn)入煙草(Nicotianatabacum)后，與非轉(zhuǎn)基因煙草植株相比，轉(zhuǎn)35S：：DREB1A基因煙草的生長(zhǎng)情況明顯滯后；但是轉(zhuǎn)rd29A：：DREB1A基因煙草植株的抗逆性明顯增強(qiáng)。Pellegrineschi等[6]用脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A驅(qū)動(dòng)DREB1A/CBF3的表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因小麥(Triticumaestivum)的抗旱性得到提高，并且沒(méi)有出現(xiàn)明顯的畸形。至今能夠用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然不多。所以，對(duì)于新的抗逆相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、各元件與轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用以及順式作用元件具體序列的確定的研究是非常重要的。因此，對(duì)兩種類(lèi)型的抗逆相關(guān)基因MvNHX1和MvDREB1啟動(dòng)子進(jìn)行克隆并分析，可有助于研究抗逆基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，也可進(jìn)一步利用MvNHX1和MvDREB1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗逆基因在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行表達(dá)。這對(duì)于了解植物的抗逆機(jī)制和提高作物的抗逆性有重要的意義。

1 材料與方法

1.1植物材料 試驗(yàn)中所用新牧1號(hào)苜蓿是由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2主要試劑 Plant Genomic DNA Kit、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和DNA Marker購(gòu)自天根生化科技有限公司，引物由華大基因合成，pMD19-T載體試劑盒、TRNzol總RNA提取試劑、SYBR Premix Ex TaqTM和染色體步移試劑盒等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3試驗(yàn)方法 根據(jù)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已克隆的兩個(gè)基因：新牧1號(hào)苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(MvNHX1)和DREB1轉(zhuǎn)錄因子基因(MvDREB1)的基因序列，分別設(shè)計(jì)引物(表1)。

表1 啟動(dòng)子克隆及熒光定量PCR中所用引物序列Table 1 Primers used for real-time PCR and promoter cloning

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量分析MvNHX1和MvDREB1基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況 用150 mmol·L-1NaCl對(duì)新牧1號(hào)苜蓿幼苗進(jìn)行脅迫后，分別在0、1、3、6、12和24 h采取葉片樣品并提取總RNA，利用紫外分光光度法測(cè)得各脅迫時(shí)間的總RNA濃度以定量總RNA，且分別反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后根據(jù)在GenBank中已登錄的苜蓿微管蛋白基因(EU664318)為內(nèi)參，按TAKARA熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)所述進(jìn)行Real-time PCR。采用相對(duì)定量2-△△Ct法計(jì)算MvNHX1和MvDREB1基因在鹽脅迫下的表達(dá)量[7]。

1.3.2MvNHX1和MvDREB1基因啟動(dòng)子的克隆 新牧1號(hào)苜蓿發(fā)芽10 d后，用天根植物基因組DNA提取試劑盒方法提取新牧1號(hào)苜蓿總DNA。用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物按照Geneme walking kit說(shuō)明書(shū)各進(jìn)行3次巢式PCR[8-9]。

第1輪PCR反應(yīng)：PCR擴(kuò)增體系為基因組DNA 1 μg，dNTP(mixture,2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，P1 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，加去離子水補(bǔ)足50 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃ 1 min，98 ℃ 1 min；運(yùn)行94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)5次；然后進(jìn)行步驟1：94 ℃ 30 s，25 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；步驟2：94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；步驟3：94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；步驟4：94 ℃ 30 s，44 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，4個(gè)步驟共循環(huán)15次；最后72 ℃ 10 min。

第2輪PCR反應(yīng)：PCR擴(kuò)增體系為0.01×第1次PCR反應(yīng)液1 μL，dNTP(mixture，2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，P2 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，加去離子水補(bǔ)足50 μL。PCR程序?yàn)榈?輪PCR反應(yīng)的步驟2～4，3個(gè)步驟共循環(huán)15次；最后72 ℃ 10 min。

第3輪PCR反應(yīng)：PCR擴(kuò)增體系為0.01×第2次PCR反應(yīng)液1 μL，dNTP(mixture， 2.5 mmol·L-1each)8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL， P3 Primer 1 μL，AP1 Primer 1 μL，LA Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，加去離子水補(bǔ)足50 μL。PCR程序同第2輪PCR反應(yīng)。

瓊脂糖電泳檢測(cè)后回收目的條帶，回收及后續(xù)的連接、轉(zhuǎn)化及酶切驗(yàn)證的具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。篩選兩個(gè)基因啟動(dòng)子的陽(yáng)性克隆送華大基因測(cè)序[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1MvNHX1和MvDREB1基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況 在鹽脅迫0、1、3、6、12、24 h后，MvNHX1基因的平均相對(duì)表達(dá)量分別為2.17%、4.05%、12.15%、9.68%、32.07%和47.33%(圖1)。這說(shuō)明MvNHX1基因的表達(dá)量在鹽脅迫后均上調(diào)，但在6 h時(shí)表達(dá)量有所降低。熒光定量PCR結(jié)果表明，在前6 h，MvNHX1的表達(dá)量上升并不明顯，但6 h后，MvNHX1表達(dá)上升極為明顯。脅迫24 h后的表達(dá)量是脅迫前的21.8倍，這說(shuō)明MvNHX1受鹽脅迫誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)幅度較大。而MvDREB1基因在不同時(shí)間鹽脅迫后，相對(duì)表達(dá)量均維持較低水平，基本在1%以下，0與24 h的相對(duì)表達(dá)均在0.3%左右，這表明MvDREB1基因表達(dá)量在鹽脅迫前后基本沒(méi)有變化。

圖1 MvNHX1基因和MvDREB1基因在不同脅迫時(shí)間的表達(dá)Fig.1 Expression of MvNHX1 and MvDREB1 genes in different stress time

2.2新牧1號(hào)苜蓿抗逆相關(guān)基因啟動(dòng)子的克隆 用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物對(duì)新牧1號(hào)苜蓿的基因組DNA進(jìn)行3輪PCR后，分別選取兩組第3輪PCR結(jié)果(圖2)中最亮的條帶即第3泳道的1 500 bp左右大小的條帶和第6泳道位于750 bp左右大小的條帶進(jìn)行回收。

圖2 MvNHX1、MvDREB1啟動(dòng)子的3次PCR結(jié)果Fig.2 Three times’ PCR results of promoters of MvNHX1 and MvDREB1

將回收得到的兩條帶分別按pMD19-T載體試劑盒說(shuō)明書(shū)和DH5α感受態(tài)細(xì)胞操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆送華大基因測(cè)序[12]。

2.3MvNHX1和MvDREB1基因啟動(dòng)子的序列分析 綜合利用plantCARE(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http:// www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)兩個(gè)啟動(dòng)子在線分析軟件對(duì)測(cè)序成功的兩條啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析[13]。

MvDREB1啟動(dòng)子克隆得到的片段經(jīng)在線綜合分析后(圖3)發(fā)現(xiàn)，MvDREB1啟動(dòng)子序列位于該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，大小為778 bp,屬于RNA聚合酶Ⅱ型啟動(dòng)子，片段中含有6個(gè)TATA序列保守區(qū)；含有4個(gè)GATA框；含有7個(gè)CAAT框等通用啟動(dòng)子元件，并且還含有5個(gè)MYC元件(參與低溫和脫水反應(yīng)，是與低溫調(diào)節(jié)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 ICE1等的識(shí)別位點(diǎn)[14])。

MvNHX1啟動(dòng)子克隆得到的片段經(jīng)綜合分析后(圖4)發(fā)現(xiàn)，MvNHX1啟動(dòng)子序列位于該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，全長(zhǎng)1 655 bp，MvNHX1啟動(dòng)子含有17個(gè)CAAT框、4個(gè)TATA框核心啟動(dòng)子元件、1個(gè)MYC元件和6個(gè)GATA框等植物啟動(dòng)子中存在的通用啟動(dòng)子元件，屬于RNA聚合酶Ⅱ型啟動(dòng)子。而且，還含有2個(gè)富含TC的重復(fù)區(qū)作為逆境反應(yīng)的應(yīng)答元件，4個(gè)G框作為光調(diào)控的作用元件等。

3 討論與結(jié)論

由熒光定量結(jié)果可知，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，MvNHX1基因的相對(duì)表達(dá)量總體上呈上升趨勢(shì)，且自6 h后，其相對(duì)表達(dá)量上升更加明顯。當(dāng)鹽脅迫時(shí)間為6 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量與3 h的相比雖有所下降，但相比協(xié)迫前表達(dá)上調(diào)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于6 h是新牧1號(hào)苜蓿MvNHX1基因耐鹽應(yīng)答機(jī)制的調(diào)整階段，也可能是由品種自身的耐鹽差異性引起的[15]。DREB轉(zhuǎn)錄因子作為AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一，也具有這個(gè)家族特點(diǎn)，就是家族成員都存在一個(gè)保守的DNA結(jié)合區(qū)——AP2/EREBP區(qū)。其中EREBP亞家族主要是調(diào)節(jié)植物對(duì)高鹽、干旱、低溫、病原及激素等的分子應(yīng)答反應(yīng)。EREBP亞家族中的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可激活一系列的抗逆功能基因的表達(dá)，提高植株的抗逆性[16]，在植物抗逆過(guò)程中起到重要作用。新牧一號(hào)雜花苜蓿MvDREB1基因與MvNHX1基因相比在鹽脅迫后上調(diào)表達(dá)并不明顯，相對(duì)表達(dá)量都很低，表明該基因與苜蓿的耐鹽性并不相關(guān)，而后續(xù)的啟動(dòng)子序列分析結(jié)果也顯示MvDREB1基因在鹽脅迫表達(dá)順式作用元件的數(shù)量上也比MvNHX1基因少很多。

圖3 MvDREB1啟動(dòng)子序列和結(jié)構(gòu)Fig.3 The sequence and structure of MvDREB1 promoter

本研究的克隆和分析結(jié)果表明，MvNHX1和MvDREB1基因啟動(dòng)子均屬于RNA聚合酶Ⅱ型啟動(dòng)子，都具有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)，含有GATA框、CAAT框和TATA框等通用啟動(dòng)子元件，而且也都含有逆境反應(yīng)的應(yīng)答元件和光調(diào)控的作用元件等各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的順式作用元件。

MvNHX1和MvDREB1基因啟動(dòng)子序列分析表明：MvNHX1基因啟動(dòng)子比MvDREB1基因啟動(dòng)子多出10個(gè)CAAT框，由于CAAT框是一種很強(qiáng)的熱誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子中的順式作用元件，能夠與HSE(heat shock response element)或STREs(stress response elements)等其他熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子中的順式作用元件共同作用誘導(dǎo)產(chǎn)生一些能夠在高溫下保護(hù)植物的熱激蛋白，所以相對(duì)于MvDREB1啟動(dòng)子，MvNHX1啟動(dòng)子更可能會(huì)在高溫時(shí)誘導(dǎo)下游基因表達(dá)；而MvDREB1啟動(dòng)子中MYC元件的數(shù)量比MvNHX1啟動(dòng)子要高出4個(gè)，MYC是與低溫調(diào)節(jié)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ICE1等的識(shí)別位點(diǎn)，所以MYC的大量存在能更多的在低溫下誘導(dǎo)基因的表達(dá)，因此MvDREB1基因啟動(dòng)子相對(duì)MvNHX1啟動(dòng)子可能使下游基因在低溫條件下更好的表達(dá)；同時(shí)兩種基因啟動(dòng)子中都含有的DRE(TACCGCACAT，脫水響應(yīng)元件)、G框、TC重復(fù)區(qū)等水分誘導(dǎo)順式作用元件，這些順式作用元件的存在使得這兩種啟動(dòng)子在干旱、脫水的環(huán)境下都可能會(huì)啟動(dòng)各自的基因表達(dá)；但是在鹽脅迫下的熒光定量PCR分析表明，MvNHX1在鹽脅迫后表達(dá)上調(diào)，而MvDREB1在鹽脅迫后仍為低水平表達(dá)，說(shuō)明這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子響應(yīng)鹽脅迫的元件有區(qū)別，這可能也與MvNHX1啟動(dòng)子中CAAT框元件和MvDREB1啟動(dòng)子中MYC元件有關(guān)，因?yàn)楸狙芯渴窃谑覝叵逻M(jìn)行的，可能由于溫度較高使得在高鹽的情況下MvNHX1啟動(dòng)子較MvDREB1啟動(dòng)子更容易啟動(dòng)基因表達(dá)。由于光、溫度、水分等環(huán)境因素影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量，各種因素對(duì)植物的影響不是孤立的，在一定程度上是相互聯(lián)系的，如低溫和高溫會(huì)造成植物生理脫水，所以，MvNHX1可能在高溫、干旱、高鹽時(shí)調(diào)控下游基因表達(dá)，MvDREB1啟動(dòng)子可能在低溫、干旱時(shí)調(diào)控下游基因的表達(dá)。所以這兩種基因啟動(dòng)子中各種作用元件之間的相互協(xié)同使得植物中同一基因啟動(dòng)子可以對(duì)多種環(huán)境脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，誘導(dǎo)基因表達(dá)，提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[17-18]。

圖4 MvNHX1啟動(dòng)子序列和結(jié)構(gòu)Fig.4 The sequence and structure of MvNHX1 promoter

研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)而構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵在于基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的識(shí)別，生物信息學(xué)方法是解決該類(lèi)問(wèn)題的重要手段之一。本研究采用“保守區(qū)段中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件掃描”和“基因啟動(dòng)子區(qū)保守區(qū)段的識(shí)別”相結(jié)合的方法進(jìn)行調(diào)控元件發(fā)掘，相比使用在線相關(guān)軟件(PLACE、PlantCARE等)對(duì)單條基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行調(diào)控元件的識(shí)別，可能會(huì)缺失對(duì)部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的識(shí)別結(jié)果，但是在一定程度上卻能增加識(shí)別結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而為揭示基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供更可靠的支撐。但生物信息學(xué)分析也存在一定誤差。因此，要準(zhǔn)確分析MvDREB1和MvNHX1基因啟動(dòng)子的功能，需要進(jìn)一步驗(yàn)證，如可以通過(guò)構(gòu)建克隆到的新啟動(dòng)子植物表達(dá)載體取代細(xì)胞中原有的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)入后，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)各種脅迫的反應(yīng)，才能確定此啟動(dòng)子的類(lèi)型以及受什么因素的誘導(dǎo)等。

本研究已克隆得到新牧1號(hào)苜蓿兩個(gè)抗逆基因MvNHX1和MvDREB1的啟動(dòng)子序列，并通過(guò)熒光定量PCR和生物信息學(xué)方法分析了兩個(gè)基因啟動(dòng)子的類(lèi)型和結(jié)構(gòu)等，但沒(méi)有對(duì)這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行分析，它們是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)調(diào)控基因表達(dá)的還有待于進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步揭示MvNHX1和MvDREB1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及后續(xù)的轉(zhuǎn)入受體植物中研究其是否能驅(qū)動(dòng)抗逆基因進(jìn)行表達(dá)從而提高作物抗逆性提供了必要的前期基礎(chǔ)。

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