垂花百合花器官離體培養(yǎng)

劉 芳，王曉麗，張彥妮，楊青杰，周蘊(yùn)薇

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.呼倫貝爾市蠶業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 162650)

百合(Liliumspp.)是世界著名的球根花卉，觀賞價值較高，培育高品質(zhì)的新品種百合來滿足日益增長的市場需求已迫在眉睫。而野生種百合則是品種選育的重要資源，野生種百合的微繁研究對于野生資源的馴化及新品種選育和遺傳性狀的改良等都極為重要[1-2]。垂花百合(L.cernum)在我國主要分布于吉林省長白山地區(qū)，在百合屬植物中屬珍稀耐寒野生種。利用組培再生的方法能夠保證原種的優(yōu)良特性和較高的繁殖系數(shù)[3]。目前，百合離體培養(yǎng)大部分以鱗片[4]作為外植體，也有以花絲[5]、花藥[6]、子房[7]、葉片[8]、胚等作為外植體取得成功的報道。垂花百合具有良好的觀賞性狀，同時也是具較強(qiáng)抗性的野生種，是百合抗性育種的重要親本。對垂花百合進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)及植株再生試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中部或內(nèi)部鱗片基部再生頻率較高，再生植株葉片基部分化能力最強(qiáng)[9]；對其鱗莖進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)鱗莖誘導(dǎo)最適宜的培養(yǎng)基為N6+0.05 mg·L-1IAA+0.50 mg·L-1KT，鱗莖萌發(fā)為完整植株的最佳培養(yǎng)基為N6+0.01 mg·L-1IAA+0.001 mg·L-1NAA[10]。但鱗莖作為地下貯藏器官，極易攜帶病菌，表面消毒后仍會不同程度地帶菌，不利于種質(zhì)長期保存和規(guī)模化生產(chǎn)；而花器官為幼嫩器官，污染小，同時研究花器官的離體培養(yǎng)也是對垂花百合生物學(xué)特性的有益補(bǔ)充。為此，本研究比較不同的激素配比條件下垂花百合花瓣、花托、子房愈傷組織的誘導(dǎo)和分化能力，篩選不同的愈傷組織誘導(dǎo)和分化效果最佳的培養(yǎng)基，以期為垂花百合的基因工程和細(xì)胞工程育種研究及百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供有益參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 選擇來源于長白山地區(qū)生長健壯、無病蟲害的垂花百合未開放的花作為外植體，進(jìn)行花器官離體培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 將垂花百合未開放的花蕾在洗衣粉水中漂洗10 min后，在流水下沖洗30 min，在超凈工作臺上用75%的無水乙醇消毒30 s，然后用2% NaClO消毒10 min，再用無菌水沖洗4～5次。用鑷子和刀將花蕾分成花瓣、花托、子房3部分，接種于添加不同濃度的6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)MS培養(yǎng)基中。每處理30個外植體，重復(fù)3次。45 d時統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，65 d時統(tǒng)計愈傷組織分化率。

誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

分化率=(分化成苗外植體數(shù)/誘導(dǎo)愈傷組織外植體數(shù))×100%[11]。

將由花瓣誘導(dǎo)出的芽經(jīng)增殖培養(yǎng)后，切成單株接入添加不同生長激素的生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基成分為1/2 MS+AC 0.5 g·L-1附加不同濃度的吲哚丁酸(IBA)及NAA。每處理30個外植體，各處理3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計生根情況。培養(yǎng)條件為(25±2) ℃，光強(qiáng)為3 000 lx，光周期為光培養(yǎng)14 h，暗培養(yǎng)10 h。

2 結(jié)果與分析

2.1不同激素配比條件下花瓣愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況 不同培養(yǎng)基對花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)效果存在顯著差異(表1)。在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1激素組合的培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)及分化效果最好，誘導(dǎo)率可達(dá)57.65%，分化率可達(dá)81.12%。當(dāng)NAA濃度升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率及分化率相應(yīng)提高，在NAA 0.1 mg·L-1水平上，花瓣未見愈傷組織形成，說明低濃度NAA不利于誘導(dǎo)愈傷組織。隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織分化成苗的分化率相應(yīng)升高，說明較高濃度的6-BA有利于愈傷組織進(jìn)行分化。

表1 不同激素配比條件下花瓣愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況Table 1 Petals,ovary,and receptacle explants callus induction and differentiation of Lilium cernum under different hormone combinations

2.2不同激素配比條件下子房愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況 在MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1激素組合的培養(yǎng)基上，子房愈傷組織誘導(dǎo)及分化效果最好，誘導(dǎo)率可達(dá)35.22%，分化率可達(dá)61.11%(表1)。并且隨NAA濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率及分化率也相應(yīng)提高，高濃度NAA與低濃度NAA的培養(yǎng)基對子房誘導(dǎo)愈傷組織的效果存在顯著差異；隨著6-BA濃度升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率先上升后下降。

2.3不同激素配比條件下花托愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況 在MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的激素組合的培養(yǎng)基上花托愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況最好，誘導(dǎo)率可達(dá)36.67%，分化率可達(dá)44.34%。在NAA 0.2 mg·L-1與不同濃度的6-BA的培養(yǎng)基中，花托愈傷組織誘導(dǎo)效果差異明顯(表1)。當(dāng)NAA濃度增加時，愈傷組織誘導(dǎo)率及分化率先增加后減少；隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率先上升后下降。由此可知，花托誘導(dǎo)愈傷組織時，6-BA和NAA的濃度均不宜過高也不宜過低。

2.4百合花器官愈傷組織誘導(dǎo)及分化的比較

2.4.1不同花器官外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的比較 垂花百合的花器官在離體培養(yǎng)過程中愈傷組織的誘導(dǎo)及分化的時間較長，外植體誘導(dǎo)愈傷組織由易到難依次為花瓣>花托>子房(圖1)。

花瓣的分化率明顯高于其他部位，且分化所需時間最短。接種3 d后花瓣顏色明顯變深呈粉色(圖1A)；20 d后部分花瓣切口處開始膨大，溝壑變明顯，花瓣顏色變淺，35 d后開始形成綠色愈傷組織，40 d開始形成不定芽(圖2B)；55 d后每個外植體上平均分化出芽4.8個，最多達(dá)14個(圖1C)。

子房的誘導(dǎo)率和分化率次之，且時間較花瓣長。接種2 d后子房明顯膨大，顏色變成黃綠色(圖1D)；40 d時繼續(xù)膨大，顏色變?yōu)榫G色，部分子房切口處產(chǎn)生帶有絨毛的白色根狀物(圖1E)；60 d后開始形成愈傷組織，65 d后開始形成不定芽(圖1F)。

花托的愈傷組織誘導(dǎo)和分化的能力介于花瓣和子房之間，所需時間較花瓣長，較子房短。接種3 d后，花托明顯膨大，表面變粗糙，顏色變?yōu)榈S綠色(圖1G)；45 d后開始形成愈傷組織，并且產(chǎn)生帶有絨毛的白色根狀物(圖1H)；60 d后白色根狀物也形成愈傷組織并產(chǎn)生不定芽(圖1I)。

2.4.2不同激素組合對花器官愈傷組織誘導(dǎo)及分化的比較 在百合組培苗誘導(dǎo)過程中，適量添加NAA對愈傷組織誘導(dǎo)及分化有明顯的促進(jìn)作用。6-BA能誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，使其大量增殖，如果6-BA濃度過高，同樣也會誘導(dǎo)部分外植體產(chǎn)生大量的不定根，從而抑制不定芽的形成，抽葉多，植株不能健壯生長和發(fā)育[12]。本研究中，花瓣、子房、花托3種外植體對低濃度的6-BA、NAA都不敏感，誘導(dǎo)花瓣愈傷組織及分化的培養(yǎng)基中6-BA、NAA濃度都很高，不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織對激素配比濃度需求不同，誘導(dǎo)愈傷組織及分化效果也有差異。這種差異可能是由于百合品種及外植體的不同導(dǎo)致的。

2.5生根與移栽 將分成單株的小苗接于含有0.5 g·L-1活性炭，附加不同生長激素濃度的1/2 MS生根培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，由花瓣誘導(dǎo)的小苗在1/2 MS+IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1的生根培養(yǎng)基中生根率最高達(dá)71.11%，平均根長達(dá)2.03 cm(表2)。隨著IBA濃度的增加，垂花百合的生根率也升高。在本研究中，活性炭的加入有利于垂花百合的生根，使根的長度增加，長勢變壯(圖1J)。將根長2～4 cm的小苗煉苗3 d，然后移栽至已滅菌的蛭石中，浸透水后放入人工氣候箱內(nèi)緩苗，15 d后移到溫室。移栽后的小苗生長良好，成活率可達(dá)80%(圖1K)。方差分析表明，不同濃度激素組合的培養(yǎng)基對百合生根率及根長的影響均有不同程度的差異。

3 討論

在百合的組織培養(yǎng)研究中，許多器官、組織都可以用作外植體，其中以鱗片作外植體的頻率最高，但鱗片取材對母本傷害大，且消毒處理難度大、易污染[4，10]，未授粉的花器官培養(yǎng)和人工授粉后的花器官培養(yǎng)對培育百合新品種和保持母本優(yōu)良特性有重大研究意義。

本研究對垂花百合花器官(花瓣、花絲、花藥、花柱、子房、花托、花梗)進(jìn)行了離體培養(yǎng)，其中花絲、花柱、花梗開始時膨大，形成愈傷組織，但后期大量褐化死亡，只有花絲在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上有兩個分化不定芽，花藥在培養(yǎng)期間未能形成愈傷組織及分化，表明垂花百合誘導(dǎo)愈傷組織由易到難依次為花瓣>花托>子房，但亞洲百合‘米麗拉’花器官組織培養(yǎng)再生植株不同部位的分化率從高到低依次為花絲、花柱、子房、花托、花瓣、花藥[13]，這可能是由供試品種的差異性導(dǎo)致的。

圖1 垂花百合花器官外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化Fig.1 Floral organ explant callus induction and differentiation of Lilium cernum

表2 不同激素組合對垂花百合生根的影響Table 2 Effects of different hormone combinations on rooting of Lilium cernum

植物生長調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)中發(fā)揮著重要的作用，在含量極低時就可以影響植物細(xì)胞的分裂、分化，以及植物體的生長、發(fā)育、形態(tài)建成等許多生理生化過程。研究表明，NAA對外植體愈傷組織誘導(dǎo)與分化起到一定的作用，較低濃度的NAA不利于誘導(dǎo)愈傷組織。這一結(jié)果與劉麗敏等[14]在百合花器官的組織培養(yǎng)中的結(jié)果一致，適宜濃度的NAA有利于百合花器官的初代誘導(dǎo)。

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