多漿旱生植物霸王質膜Na╋/H╋逆向轉運蛋白基因RNAi載體構建

馬 清，王鎖民

(草地農業生態系統國家重點實驗室 蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

霸王(Zygophyllumxanthoxylum)為蒺藜科(Zygophyllaceae)多漿旱生灌木，其抗逆性強，是亞洲中部荒漠區的特有植物種，也是我國西部荒漠區植被組成的優勢建群種，具有很高的生態和飼用價值[1-4]。Wang等[5]發現霸王適應干旱環境的最有效策略是吸收并積累大量的Na+。進一步分析發現，干旱脅迫下，霸王存在著一種非常強大的長距離運輸能力，能夠將根系吸收的大量Na+及時有效地轉運至葉中，用以維持細胞的滲透勢[6-7]，而質膜Na+/H+逆向轉運蛋白SOS1可能在植物體內Na+的長距離運輸及空間分配中發揮重要作用[8-9]。為此，蘭州大學草類逆境生理與基因工程實驗室從霸王中克隆了質膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因ZxSOS1(Genebank登錄號:GU177864)，但ZxSOS1在霸王體內Na+轉運中的功能及其在霸王適應干旱生境中的作用機制尚不清楚。

在基因功能研究中，RNA干擾技術(RNA interference,RNAi)已成為一種簡單、高效、特異和成本相對低廉的研究手段，它可以在mRNA水平上使特定基因的表達活性喪失或下降，從而獲得功能性突變或喪失，進而可根據表型變化鑒定目標基因的功能[10-11]。因此，本研究構建以霸王ZxSOS1基因為靶標的、具有反向重復發卡結構的RNAi表達載體，旨在為利用RNAi技術深入研究ZxSOS1在霸王體內Na+長距離運輸及空間分配中的功能及其作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料 霸王種子于2006年7月采自內蒙古阿拉善左旗巴彥浩特。pHANNIBAL質粒、PART27質粒和大腸桿菌E.coliDH5α菌株均為蘭州大學草類逆境生理與基因工程實驗室保存，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.2試劑 UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR擴增試劑盒和UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程公司，克隆載體pGM18-T Easy vector、限制性內切酶和T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司，DNA marker購自北京天根生化科技有限公司，其他生化試劑均為進口或國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取 取50 mmol·L-1NaCl處理24 h的3周齡霸王幼苗根系，加入液氮研磨至粉末狀，按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的操作說明書提取根系總RNA。用1.0%甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性和質量。

1.2.2ZxSOS1基因RNAi靶位片段的擴增 cDNA第一鏈的合成按照MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒的操作說明進行。

利用GenBank中的RNAi設計庫對ZxSOS1基因的靶位區段進行篩選，選取629 bp(第2 750～3 379位堿基)區段作為RNAi最佳靶位區段設計一對特異性引物，為了便于定向連接到中間載體pHANNIBAL，在上游引物P1上引入酶切位點Xba Ⅰ和Xho Ⅰ序列，下游引物P2上引入酶切位點Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ序列。具體引物序列如下(劃線部分為酶切位點序列)：

P1:5′-TCTAGACTCGAGTCAACAATGACTGTATACTT-3′；

P2:5′-AAGCTTGGTACCAATTTCCTCAAATCACGCTT-3′。

PCR擴增反應體系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl23 μL，2 mmol·L-1dNTP 5 μL，10 μmol·L-1P1 1 μL，10 μmol·L-1P2 1 μL，Taq DNA polymerase (5 U· μL-1)0.5 μL，cDNA 2 μL，加水至50 μL。反應條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s、53 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，目的片斷的回收和純化按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒操作說明進行。回收的PCR產物連接到pGM18-T Easy vector載體，轉化感受態大腸桿菌E.coliDH5α，用含有50 g·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養基進行藍白斑篩選，陽性克隆經質粒PCR鑒定確認后，送至華大基因科技股份有限公司進行基因測序，使用DNAMAN生物軟件對序列進行分析。

1.2.3以ZxSOS1為靶標的RNAi載體構建 用Xho /ⅠKpn Ⅰ雙酶切pGM18-T Easy vector載體，回收小片段(S1)，與經同樣雙酶切并回收的載體pHANNIBAL連接，轉化感受態E.coliDH5α，得到重組質粒pHS1；然后用Xba Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切pGM18-T Easy vector載體并回收反向小片段(S2)，與經同樣雙酶切并回收的pHS1載體相連，得到以pHANNIBAL載體的內含子(intron)部位作為間隔區的、具有發卡反向重復序列的中間載體pHS1S2(圖1)；最后用Sac Ⅰ/Spe Ⅰ雙酶切pHS1S2，回收大片段，與經同樣酶切回收的PART27載體相連，得到具有ZxSOS1反向重復序列的植物RNAi表達載體PARS(圖2)。

圖1 中間載體pHS1S2的構建

圖2 ZxSOS1 RNAi載體PARS的構建

2 結果與分析

2.1總RNA的提取及檢測 以霸王根系為材料提取總RNA，甲醛變性凝膠電泳檢測結果顯示28 S rRNA、18 S rRNA條帶清晰(圖3)，前者亮度約是后者的2倍，說明所提取的RNA完整性較好；經NANODROP1000核酸蛋白檢測儀測得OD260 nm/OD280 nm平均值為2.01，表明RNA純度較高，可以用于RT-PCR擴增實驗。

圖3 霸王根系總RNA的甲醛變性凝膠電泳圖

2.2ZxSOS1基因靶位片段的確定及擴增 利用GenBank中的RNAi 設計庫對ZxSOS1基因的靶位區段進行篩選，結果表明，ZxSOS1基因從起始密碼開始第2 750～3 379位堿基共629 bp的片段為保守區段。以總RNA反轉錄所得到的第一鏈cDNA為模板，用特異引物P1和P2進行PCR擴增，得到了預期大小的特異條帶(圖4)。將此條帶回收純化后連接到pGM18-T Easy vector載體上，轉化E.coliDH5α。從轉化的平板上隨機挑取3個菌斑并提取質粒，進行PCR擴增，得到了629 bp的預期條帶(結果未顯示)，表明這些克隆為陽性克隆。對其進行測序后分析表明，該序列與ZxSOS1基因相應區段同源性100%(結果未顯示)，說明已成功擴增到目的片段。

圖4 RT-PCR產物凝膠電泳圖

2.3以ZxSOS1為靶標的RNAi載體構建 按照ZxSOS1 RNAi植物表達載體的構建流程(圖1、圖2)，通過酶切和連接的方法，構建了具有ZxSOS1反向重復序列的植物RNAi表達載體PARS。通過PCR檢測鑒定出PARS的陽性重組質粒后(圖5)，根據PARS載體上的限制性位點對其進行如下酶切分析：經Xho Ⅰ/Kpn Ⅰ雙酶切后，在800和629 bp處出現特異條帶(圖6，泳道1)，分別與PDK intron和S1片段大小相符；經Xba Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切后，在629 bp處出現特異條帶(圖6，泳道2)，與S2片段大小相符；經Sac Ⅰ/Spe Ⅰ雙酶切后，在約4 500 bp處出現特異條帶(圖6，泳道3)，與CaMV 35S啟動子、S1、PDK intron、S2及OCS終止子片段之和大小相符。以上結果表明，以ZxSOS1為靶標的RNAi載體已經構建成功。

圖5 PARS重組質粒陽性克隆的PCR鑒定

3 討論與結論

生長在荒漠地區的多漿旱生植物霸王具有極強的抗逆性，可能蘊藏著豐富的抗逆基因資源[7]。基因沉默是研究基因功能的常用手段，包括反義核酸、基因敲除和RNAi等技術[12]。相比其他基因沉默方法，RNAi具有高效性，只需要少量小干擾RNA(small-interference RNA,siRNA)或雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)即可使特定基因沉默[11,13]；且沉默效應能通過植物胞間連絲及韌皮部進行系統擴散[14-19]；同時植物中的RNAi沉默效應可以從起始siRNA同源區向臨近的5′和3′端擴散，進而可增強基因沉默的效果[20]。因此，RNAi已逐漸成為一種研究植物基因功能的強有力工具。

圖6 PARS的酶切分析

RNAi的關鍵是其載體的構建，載體結構、靶基因序列長度及其在靶基因中的位置將直接影響基因沉默的效果[21]。RNAi載體以含有2個反向重復序列中間夾1個內含子所形成ihpRNA發卡結構的沉默效果最好，平均比例較高，超過90%[22]，其發夾結構臂序列的長度具有一定的可塑性，一般在100～1 200 bp[23]。Elbashir等[24]和Reynolds等[25]建議靶基因序列應在基因轉錄起始位點下游100個核苷酸以后，且該段DNA的GC含量在40%～52%。本研究構建的RNAi載體的2個反向重復序列臂之間具有內含子，且兩臂大小也在目前公認的序列長度范圍之內，選取的ZxSOS1基因靶序列GC含量為44%。因此，該載體完全滿足高效RNAi載體的條件，理論上將會對ZxSOS1基因產生較好的沉默效果。

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