鈍裂銀蓮花ISSR-PCR反應體系優化

孫 濤，劉左軍，孫文斌，劉鳳梅，李 冰

(蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050)

ISSR(Inter-simple sequence repeat)又稱簡單重復序列擴增，是由Zietkiewicz等[1]1994年提出的一種DNA標記技術，是近年來發展起來的一類新型的分子標記技術。ISSR標記技術具有無需知道任何靶標序列的微衛星背景信息、遺傳多態性高、檢測快等特點，在植物分類與進化、遺傳多樣性研究以及遺傳圖譜構建和基因定位方面具有廣泛的應用前景[2]。雖然ISSR-PCR具有重復性高的優點[3]，但不同材料、不同引物的擴增條件有異，反應體系不同也可產生不同的結果。因此，有必要建立與優化不同實驗材料的ISSR-PCR的反應體系和擴增程序，以期獲得穩定、可靠的ISSR 分析結果。

鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)為毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亞科銀蓮花屬(Anemone)[4]植物。分布于喜馬拉雅山區和青藏高原東緣，祁連山、帕米爾高原一帶，多數分布于西南部。由于其生長海拔高、生境分布廣泛、進化較為低等，是很好的分子遺傳學和分子生態學的研究材料[5]。因此，本研究通過提取甘肅合作的高寒草甸地區鈍裂銀蓮花的DNA，采用ISSR分子標記技術，對銀蓮花進行ISSR-PCR反應條件優化，以期建立重復性高、反應條件穩定的反應體系，為深入研究高寒草甸銀蓮花屬植物遺傳多樣性[6]奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1材料 鈍裂銀蓮花樣品采集于甘肅省甘南藏族自治州合作市(海拔2 973 m，34°57′ N，102°53′ E)，材料采后立即放入保鮮袋中，用硅膠干燥保存。

1.2實驗藥品與儀器 引物UBC807(AG)8T、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、100 bp DNA Ladder Plus Marker(購自上海生物工程有限公司)，PCR儀(型號MG96+，杭州朗基科學儀器有限公司生產)、電泳儀(型號DYY-11，北京六一儀器公司生產)。

1.3DNA的提取及檢測 采集鈍裂銀蓮花幼苗期嫩葉，采用改良的CTAB法[7]提取獲得基因組DNA，即用氯仿-異戊醇抽提之前加用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，以減少酚類物質和其他雜質的含量。用紫外可見分光光度計測定260、280 nm處的吸收值，計算DNA的含量。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質量。

1.4ISSR-PCR反應體系設計與PCR擴增

1.4.1ISSR-PCR反應體系正交試驗設計 采用L16(54)正交試驗設計對模板濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度進行5因素4水平篩選(表1、表2)。

按表2設計的16個反應體系組合，每個處理重復2次進行加樣，PCR反應體系總體積為20 μL。PCR擴增程序[8]：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，引物退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環35次；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓為100 V) 分析擴增產物，凝膠成像系統觀察成像記錄。

表1 ISSR-PCR反應體系的因素與水平

表2 ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計

1.4.2ISSR-PCR反應體系的單因素試驗設計 在正交試驗的基礎上，對反應體系中各因素進行單因素試驗。將正交體系中得到的特異性譜帶清晰、譜帶多態性較高，且譜帶穩定的體系中的5個因素最優水平的設為固定值，對單個因素進行梯度篩選，將篩選出的該因素的最佳值作為固定值，然后將其他4個因素中的一個作為變量進行梯度篩選，其他3個固定因素不變，這樣，依次完成對各因素的篩選，從而得到最佳反應體系[9-10]。

2 結果與分析

2.1DNA的提取與檢測 提取高質量的鈍裂銀蓮花基因組的DNA是ISSR擴增成功與否的關鍵。本試驗用改進的CTAB法，所提取的DNA的電泳顯示在點樣孔附近都呈現出一條亮帶；且條帶整齊明亮，沒有明顯的拖尾，也未見RNA條帶，說明提取的DNA質量高，完整性好，可用于ISSR體系優化分析和其他試驗(圖1)。

2.2ISSR-PCR反應體系的正交優化 參照何正文等的方法[11]，根據本試驗的正交設計PCR擴增結果和電泳檢測，依據瓊脂糖電泳譜帶的強弱和雜帶的多少進行直觀分析。不同處理間，由于dNTP、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶的濃度不同，其擴增結果存在明顯差異(圖2)。反應體系1、9、14沒有條帶出現；2、5、13拖帶，背景較重；4擴增條帶較弱，但多態性較高;6擴增條帶的多態性較低，且譜帶較弱；8、16只有兩條清晰的條帶，擴增條帶的多態性較低；16為模板、dNTP濃度和Mg2+濃度過高，使Taq DNA聚合酶的活性降低，反應不完全；10、11、12、15擴增條帶的多態性較低，且譜帶較弱；3、7擴增條帶多態性高，且較清晰，但7中 Taq DNA聚合酶濃度過低，可能會使反應無法充分進行，從而影響擴增效果[12]。最佳組合應選擇特異性譜帶清晰、譜帶多態性較高，且譜帶穩定的組合[13]，故本試驗選擇反應體系3為最佳組合，即20 μL ISSR-PCR反應體系中含有模板20 ng、10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs 0.3 mmol·L-1、引物0.4 mmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1、和3 U Taq DNA聚合酶。

圖1 鈍裂銀蓮花24個樣品基因組DNA電泳檢測

圖2 正交試驗設計ISSR-PCR反應體系的擴增結果

2.3ISSR-PCR反應體系的單因素試驗

2.3.1不同模板DNA濃度對ISSR-PCR反應體系的影響 DNA模板的質量和用量是ISSR-PCR擴增效果的重要影響因素[14]，用量過高會出現非特異性擴增，甚至抑制擴增的進行，濃度過低則得不到擴增產物。本試驗設置了4個模板DNA的梯度(圖3)，模板DNA為20 ng時，擴增條帶多且較亮；為40 ng時，擴增條帶清晰且背景弱；為60、80 ng時，擴增條帶較強，背景較亮，多態性較差。因此，本試驗選擇40 ng為反應體系中模板DNA的用量。

2.3.2dNTP濃度對ISSR-PCR反應體系的影響 dNTP作為ISSR-PCR反應的原料參與新鏈DNA的合成過程。在PCR反應中，dNTPs的用量影響到堿基摻入的正確與否以及擴增產率的高低，濃度過高或過低都導致分子量相對較大的條帶得不到有效擴增。本試驗設置了0.1、0.2、0.3和0.4 mmol·L-1共4個濃度梯度。dNTPs濃度為0.1 mmol·L-1時擴增條帶模糊，為0.2 mmol·L-1時，擴增條帶清晰，但背景較高，0.3 mmol·L-1時擴增條帶清晰，背景清晰，產率最高，0.4 mmol·L-1時出現非特異性條帶(圖4)。因此，鈍裂銀蓮花ISSR-PCR反應體系選擇0.3 mmol·L-1的dNTPs濃度。

圖3 不同的模板DNA用量下的擴增結果

圖4 不同的dNTP濃度用量下的擴增結果

2.3.3Mg2+濃度對ISSR-PCR反應體系的影響 Mg2+作為TaqDNA聚合酶的輔因子，它影響著TagDNA聚合酶的活性、退火溫度和產物的特異性，而且能和反應體系中的dNTP、模板DNA和引物結合，影響它們的有效濃度[15]，從而影響ISSR-PCR擴增結果。本試驗驗設置了1.0、1.5、2.0和2.5 mmol·L-1共4個梯度。當Mg2+濃度為1.0 mmol·L-1時擴增條帶不穩定且背景較重，1.5 mmol·L-1時擴增條帶不穩定，2.0 mmol·L-1時擴增條帶減少，2.5 mmol·L-1時能擴增出清晰穩定的條帶且無非特異性擴增(圖5)。因此，在鈍裂銀蓮花遺傳多樣性ISSR分析中，Mg2+濃度以2.5 mmol·L-1較為適宜。

圖5 不同的Mg2+濃度用量下的擴增結果

2.3.4TagDNA聚合酶濃度對ISSR-PCR反應體系的影響 在PCR反應中，Taq DNA聚合酶的用量是擴增結果的一個重要因素。用量過多不僅增加試驗成本，而且容易擴增出非特異性條帶。本試驗設置了1、2、3、4 U共4個梯度。當酶的用量為1 U時條帶很弱，說明酶用量不足，2 U時條帶清晰且非特異性條帶少，產物穩定，3和4 U時條帶強度明顯增強，但有非特異性條帶出現(圖6)。因此，在鈍裂銀蓮花遺傳多樣性ISSR分析中，Taq DNA聚合酶以2 U較為適宜。

2.3.5引物濃度對ISSR-PCR反應體系的影響 PCR中過高的引物濃度會造成引物二聚體。因此，本試驗設置0.2、0.3、0.4和0.5 mmol·L-14個濃度梯度。濃度在0.2和0.3 mmol·L-1時，擴增條帶弱，背景較亮，而在0.4和0.5 mmol·L-1時，可以擴增出較為清晰穩定的條帶(圖7)。因此，在鈍裂銀蓮花遺傳多樣性ISSR分析中，最佳引物濃度為0.4 mmol·L-1。

圖6 不同TagDNA聚合酶濃度用量下的擴增結果

圖7 不同的引物濃度用量下的擴增結果

3 討論

本試驗利用正交設計的方法得到了鈍裂銀蓮花ISSR-PCR反應的最佳試驗條件的組合，即：20 ng、10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs 0.3 mmol·L-1、引物0.4 mmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1和3 U Taq DNA聚合酶。但該方法也存在著一定的局限性，不能很好地估計試驗誤差。在正交試驗的基礎上，結合單因子試驗的方法，這兩種方法的結合，不僅克服了正交試驗主觀上造成的誤差，也克服了單因素忽視了各因子間的相互效應的影響，所得到的模板、dNTPs和引物最佳濃度是一致的，證明了試驗的可信度[16-17]；另外在Taq DNA聚合酶和Mg2+最佳濃度的確定上，兩種方法的結果存在差異，這可能與PCR反應的不穩定性有關系，也可能是由于兩者各自的局限性所造成的。結合兩種方法，盡可能減少試驗誤差。該試驗中模板量較低，擴增條帶弱且少，模板量較大，擴增條帶較強；dNTPs濃度對結果影響較小，較低濃度擴增條帶模糊，較高出現非特異性條帶；Mg2+濃度過低造成擴增產物量不足，過高出現非特異性擴增。說明鈍裂銀蓮花ISSR反應體系對Mg2+濃度較為敏感；Taq DNA聚合酶濃度過低條帶弱，過高出現非特異性產物且成本過高；引物濃度對結果影響不太明顯，都有條帶出現，說明體系對引物的濃度不敏感[18-19]。

致謝：本研究得到了蘭州大學高寒草甸與濕地生態系統定位研究站的支持與幫助，在此衷心感謝！

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