海洋放線菌YH91分類鑒定及其抑菌活性的研究

王 皓,劉 秋,孫建龍,閆建芳,趙柏霞,劉志恒

(1.沈陽農業大學 植物保護學院,遼寧 沈陽 110161;2.大連民族學院 生命科學學院,遼寧 大連 116600)

很多放線菌能夠產生具有廣譜殺菌效果的次生代謝產物。據不完全統計,放線菌產生的活性次生代謝產物約占目前已發現微生物活性次生代謝產物的50%[1]。海洋微生物具有不同于陸地微生物的代謝途徑,可產生完全不同于陸地微生物的新穎生物活性物質[2],因此海洋放線菌在新型抗生素以及生物農藥的開發等方面具有巨大潛力。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)是導致食品污染和人類感染的主要細菌,而它們又分別是 G+和 G—的代表菌。鐮刀菌屬真菌(Fusarium moniliforme)是植物產后病害的重要病原菌之一,危害水稻、小麥、玉米等作物,造成嚴重減產,其中一些菌種也可引起人類疾病,且有致癌作用[3]。選用上述 3種菌為供試菌株,通過對海洋沉積物中分離得到的海洋放線菌抑菌活性測定,篩選到一株海洋放線菌 YH91,其發酵液能夠抑制所選供試病原菌,并且抑菌活性穩定。通過對該菌株的鑒定及其抑菌活性的研究,為下一步代謝產物的研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

采集遼寧省大連市龍王塘西口距離海岸 300 m的海洋沉積物,從中分離得到海洋放線菌 YH91,于-80℃冰箱中凍干保存。

1.1.2 培養基

菌種鑒定培養基：高氏一號培養基、蔗糖硝酸鹽瓊脂培養基、燕麥粉瓊脂培養基、無機鹽淀粉瓊脂培養基、甘油天冬素瓊脂培養基、馬鈴薯塊培養基、營養瓊脂培養基、淀粉瓊脂培養基;發酵培養基：高氏一號液體培養基;抗菌活性測定培養基：PDA 培養基、牛肉膏蛋白胨培養基。以上培養基的配方參照文獻[4-5]。

1.2 方法

1.2.1 形態特征以及培養特征研究

用高氏一號培養基劃線埋片,于28℃下培養5 d后,用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌株 YH91形態特征。于 7種菌種鑒定培養基分別劃線,在 28℃下培養7 d,進行培養特征觀察。

1.2.2 生理生化特性

參照文獻[6-8]進行生理生化特性鑒定。

1.2.3 細胞壁化學組分分析

全細胞壁氨基酸和全細胞水解產物糖組份分析采用Stanek等[9]和王平[10]的的快速薄板層析法(TLC)進行。

1.2.4 16S rDNA的擴增及其同源性比較

用微波法[11]進行放線菌總DNA的提取。以培養至對數期的新鮮菌絲體基因組DNA為模板,采用原核生物通用引物F27及R1492(由上海生工公司合成)進行16S rDNA序列擴增,引物序列為F27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;R1492：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’,PCR 反應體系和反應條件見參考文獻[12],用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物檢測。采用DNA純化試劑盒(寶生物(大連)工程技術有限公司)進行 PCR擴增產物的回收pMD19-T克隆試劑盒(寶生物(大連)工程技術有限公司)進行 PCR擴增產物的連接以及連接產物的轉化,由北京三博遠志生物公司進行16S rDNA 序列分析。將所測得的YH91的16S rDNA序列同NCBI數 據 庫 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中 已有序列進行比對分析,利用MEGA5.0軟件構建N-J(Neighbor-joining)系統進化樹,確定菌株的分類地位。

1.2.5 抑菌物質活性測定

用接種針取YH91孢子接種于裝有100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中,于28℃ 150 r/min培養7 d制備菌株YH91發酵液,發酵液在8 000 r/min條件下離心5 min。上清液過0.45 μm濾膜,采用管碟法[13]測定上清液對3種指示菌的抑菌活性。

1.2.6 抑菌物質穩定性研究

取5 mL(原始PH 7)YH91發酵上清液9份,進行9種處理,Ⅰ：未處理作為對照;Ⅱ：100℃,0.5 h;Ⅲ：pH 2,24h;Ⅳ：pH 12,24 h;Ⅴ：pH 2,24 h,再 100℃,0.5 h;Ⅵ：pH 12,24 h,再 100℃,0.5 h;Ⅶ：紫外照射0.5 h;Ⅷ：紫外照射 1 h;Ⅸ：紫外照射 3 h。檢測上清液的抑菌活性,以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及鐮刀菌屬作為指示菌,細菌于 37℃培養 24 h,真菌于28℃培養60 h,記錄抑菌結果并進行顯著性檢驗。熱處理部分在恒溫水浴鍋中進行,pH調節采用3 mol/L HCL和3 mol/L NaOH;所有試驗設3個重復。

2 結果

2.1 形態特征

取 YH91玻片在光學顯微鏡下觀察,其基內菌絲細長多分支,色澤淺而透明,相互交織成網狀。電子顯微鏡觀察孢子絲呈不規則分枝狀,孢子卵圓或圓形, 孢子之間無縊縮, 大小為 (0.8～1.1)μm×(1.1～1.4)μm,孢子表面有紋飾(圖1)。

圖1 菌株YH91的掃描電鏡圖(×7 000)Fig.1 Scanning electron micrograph of strain YH91(×7 000)

2.2 培養特征

利用不同培養基培養,YH91產生的氣生菌絲與基內菌絲的顏色各不相同,均不產生可溶性色素,除在馬鈴薯塊培養基上長勢一般外,在其余培養基長勢良好。具體結果見表1。

表1 菌株YH91的培養特征Tab.1 Cultural characteristics of strain YH91

2.3 生理生化特性

YH91菌株能液化明膠、還原硝酸鹽、不胨化牛奶、不水解淀粉、不水解纖維素、不產生黑色素,不產硫化氫。能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露醇,不利用果糖、蔗糖、木糖、棉子糖、肌醇。YH91與淀粉酶鏈霉菌(S.diastaticus)具體形態特征及生理生化特征的比較見表2。

2.4 細胞壁化學類型

經TLC全細胞水解液分析發現,菌株YH91細胞壁組成中含 L,L-DAP;有葡萄糖,無阿拉伯糖、甘露糖、木糖和馬杜拉糖等特征性糖。其細胞壁氨基酸型為I型,糖型為C型。符合鏈霉菌屬(Streptomyces)的化學分類特性。

表2 菌株YH91形態特征及生理生化特征Tab.2 Morphological characteristics and physiological and biochemical properties of strain YH91

2.5 16S rDNA的擴增及序列分析

菌株YH91的16S rDNA序列長度為1 450 bp,NCBI的序列登記號為：JN205799.將所測序列與GenBank數據庫中的相關菌種進行比較,其與Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus的序列相似性為99.4%。構建以16S rDNA全序列為基礎的系統發育樹,結果如圖2所示。

圖2 菌株YH91系統進化發育樹Fig.2 Rooted phylogenetic tree of strain YH91

2.6 抑菌物質活性分析

由圖3可見,YH91的發酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及鐮刀菌都具有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑分別達到32、34和29 mm,說明該活性物質為一類廣譜抗生素。

圖3 YH91對不同病原菌的抑制結果Fig.3 Bacteriostatic activities of strain YH91 to different bacteria

2.7 抑菌物質穩定性分析

由表3可見,發酵液在經過酸、堿、高溫及紫外照射處理后,抑菌圈直徑大小沒有明顯改變。在0.05水平進行顯著性檢驗,結果顯示其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用經堿處理后略有下降,對鐮刀菌的抑制作用經酸處理后略有下降,其余各組與未經處理的上清液無顯著差異。說明鏈霉菌YH91所產生的活性物質對酸、堿、熱以及紫外照射的穩定性較好。

表3 YH91抗菌活性物質穩定性試驗結果Tab.3 The stabilities of the antimicrobial substances produced by strain YH91

3 討論

據 Pridham 等[14]的報道,S.diastaticus subsp.ardesiacus的孢子絲螺旋形,孢子表面光滑,氣生菌絲為石板灰色,基絲無色,能水解淀粉,能使牛奶凝固并胨化,不能液化明膠：而菌株YH91的孢子絲為不規則分枝,孢子表面有紋飾,氣生菌絲為淺粉色、乳白色或灰白色,基內菌絲為淡紫色或粉色,不能水解淀粉,能凝固牛奶但不能使牛奶胨化,能液化明膠。綜上所述,菌株YH91與S.diastaticus subsp.ardesiacus的形態特征、培養特征及生理生化特性存在較大的差異。因而認為菌株YH91為S.diastaticus subsp.ardesiacus的一株亞種。

目前,從天然資源中尋找活性物質代替化學農藥以及開發天然抗菌化合物已成為研究的重點[15]。海洋放線菌 YH91的發酵液能夠有效抑制金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)以及鐮刀菌(F.moniliforme)的生長,經酸、堿、熱及紫外線的處理之后,抑菌物質的活性受到的影響較小,表現出良好的穩定性,在生物防治以及醫藥研究等方面的研究具有潛在價值,其活性物質的分離、純化和結構解析等研究正在進行中。

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