DLC-1、FAK及p130Crk相關底物在卵巢上皮性癌中的表達及意義

任 芳，史惠蓉，陳志敏，樊冬梅，劉慧娜，紀 妹，韓麗萍

(鄭州大學第一附屬醫院婦產科 河南鄭州 450052)

卵巢癌是女性生殖器官3大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首，5年生存率僅25%～30%，已成為威脅婦女生命和健康的主要原因。卵巢癌由于缺乏早期診斷方法，發現時多數已屬晚期，且有約60%～70%患者在治療中發生耐藥和復發轉移。因此，尋找能早期診斷及判斷預后的相關因子，以及有效治療靶點是目前卵巢癌研究的重點。肝癌缺失因子-1(deleted in liver cancer-1，DLC-1)［1，2］是一種腫瘤抑制基因，與細胞凋亡、腫瘤浸潤轉移關系密切。粘著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一類非受體型胞質蛋白酪氨酸激酶，分布在細胞粘著斑部位［3］。信號分子p130Crk相關底物(Crk-associated substrate 130 kDa，p130Cas)是一種高度磷酸化的蛋白質，在細胞的惡性轉化、腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發揮著重要的作用［4，5］。本研究應用免疫組化技術檢測DLC-1、FAK和p130Cas在正常卵巢組織及卵巢上皮性癌中的表達，分析3者在卵巢上皮性癌中表達之間的相關性及其與卵巢癌臨床病理指標之間的關系，探討DLC-1、FAK和p130Cas的檢測對于卵巢上皮性癌早期診斷和預后分析存在的潛在價值。

1 臨床資料與方法

1.1 臨床資料 收集2006年至2008年鄭州大學第一附屬醫院婦科手術存檔蠟塊，其中正常卵巢組織(因子宮肌瘤而行卵巢切除者)22例，卵巢上皮性癌62例。62例卵巢癌患者的年齡19～73歲，中位年齡50歲。所有標本均為初次診斷，術后經病理學診斷證實，患者術前均未經過放療和化療。

1.2 主要試劑 山羊抗人DLC-1多克隆抗體(ab21200，稀釋濃度為1∶100)購自英國Abcam公司;鼠抗人FAK單克隆抗體(SC-1688，稀釋濃度為1∶50)為美國Santa Cruz公司產品;p130Cas鼠抗人單克隆抗體購自美國Neomarkers公司;免疫組化SP、PV試劑盒及DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。1.3 免疫組織化學方法 常規4 μm厚度連續切片、貼片、脫蠟。免疫組織化學染色按照試劑盒的操作步驟進行。所有切片染色均在相同條件下進行，每批染色均設陽性對照和陰性對照。結果判定:以胞漿內有黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞。染色強度:無著色(0分);染色淡黃(1分);染色黃(2分);染色棕黃(3分)。陽性細胞數:陽性細胞數量的百分比≤5%(0分);5%＜陽性細胞數量的百分比≤25%(1分);25%＜陽性細胞數量的百分比≤50%(2分);陽性細胞數量的百分比＞50%(3分)。最終評分=染色強度×陽性細胞數。根據分值可將染色結果分為:陰性:0-1分;陽性:＞2分。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理，計數資料采用 χ2檢驗;相關性檢驗采用Spearmen等級相關分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌和正常卵巢組織中的表達情況 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌中的陽性表達率分別為54.8%、79.0%和87.1%;在正常卵巢組織中的陽性表達率分別為100%、27.3%和31.8%。DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌中的表達與正常卵巢組織相比，其差異均有統計學意義(P＜0.05)。

表1 DLC-1和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織和正常卵巢組織中的表達

2.2 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達與臨床病理特征間的關系 DLC-1蛋白的表達與卵巢癌的FIGO分期、有無腹水和淋巴結轉移有關(P＜0.05)，與組織學類型、分化程度和年齡無關(P＞0.05)。FAK蛋白的表達與卵巢癌的分化程度、有無腹水和淋巴結轉移相關(P＜0.05)。p130Cas蛋白的表達與卵巢癌的FIGO分期和有無淋巴結轉移有關(P＜0.05)。見表2。

2.3 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織中表達的相關性 DLC-1與FAK蛋白表達呈負相關(r=－3.08，P=0.015)。DLC-1和p130Cas蛋白表達之間呈負相關(r=－0.330，P=0.006)。

表2 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白的表達與卵巢癌臨床病理特征的關系

3 討論

3.1 DLC-1在卵巢上皮性癌中的表達及其意義 肝癌缺失基因(DLC-1)是1998年采用再現差異分析法發現的一種新的抑癌基因，在人類多種腫瘤中呈低表達或表達缺失。DLC-1蛋白是RhoA和Cdc42特異性的GTP酶激動蛋白，參與基因轉錄、細胞周期調控及信號傳導通路的調節，與細胞凋亡、腫瘤浸潤轉移及細胞骨架形成關系密切［6，7］。

Kim等［2］對肝癌細胞株的研究發現DLC-1的過表達可以抑制腫瘤細胞的移行。Peng等［8］研究發現，鼻咽癌中DLC-1的表達與腫瘤局部浸潤的范圍有關。而卵巢癌組織中的DLC-1表達情況報道很少。本研究發現，卵巢癌中DLC-1蛋白表達明顯低于正常卵巢組織(P＜0.05)，表明DLC-1的低表達與卵巢癌的發生密切相關。在臨床期別晚、有腹水、有淋巴結轉移的卵巢癌患者中，DLC-1表達顯著降低(P＜0.05)，表明DLC-1與卵巢癌的侵襲轉移等生物學行為有直接關系。國外研究［9，10］發現肝癌和乳腺癌細胞系中DLC-1的腫瘤轉移抑制作用，也從另一角度支持本研究的發現。

3.2 FAK在卵巢上皮性癌中的表達及其意義 粘著斑激酶(FAK)是一個多功能的非受體酪氨酸激酶，它在細胞間及細胞與細胞外基質粘附中起關鍵作用，在許多腫瘤組織中都有FAK表達增加。FAK激活后，介導整合素、FAK/Src等多條信號傳導途徑來參與細胞的分化、增生以及腫瘤的侵襲與轉移等過程［11，12］。

Fujii等［13］發現，FAK在肝癌組織中呈過度表達;另外，Aalbers等［14］發現，在結直腸癌中FAK的高表達與腫瘤侵襲和轉移有密切關系。本研究顯示，卵巢癌中FAK蛋白的表達顯著高于正常卵巢組織(P＜0.05)。在腫瘤分化程度低、有腹水、有淋巴結轉移的卵巢癌患者中，FAK表達顯著增高(P＜0.05)。表明高表達的FAK可能促進卵巢癌細胞的惡性增殖和轉化，且與卵巢癌的浸潤轉移有關。

3.3 p130Cas在卵巢上皮性癌中的表達及其意義

p130Cas最初在癌基因V-src和V-crk轉化的細胞中鑒定出來的一個高度磷酸化的蛋白質［4，5］。作為整合素通路中關鍵的信號分子，p130Cas不僅參與細胞黏附、遷移、存活和增生等一系列的生理過程，還在細胞惡性轉化、腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發揮著重要的作用。

Wei等［4］發現p130Cas與肺癌細胞的抗失巢生長密切相關。Wendt等［5］發現在乳腺癌中，p130Cas表達的降低能逆轉腫瘤細胞侵襲和早期的遠處播散。本研究發現在卵巢上皮性癌組織中p130Cas的蛋白表達明顯高于正常卵巢組織。在臨床期別晚、有淋巴結轉移的卵巢癌患者中，p130Cas表達顯著增高(P＜0.05)。提示p130Cas在卵巢上皮性癌組織中的高表達可能與卵巢癌的浸潤轉移和病程進展有關。

3.4 DLC-1和FAK及p130Cas在卵巢上皮性癌組織中表達的相關性 DLC-1定位于局部黏著斑，因此要發揮其腫瘤抑制活性，對局部黏著斑的定位是必需的［15］。Kim等［2］在肝細胞癌中研究發現:DLC-1可導致局部黏著斑蛋白如黏著斑激酶(FAK)、信號分子p130Crk相關底物(p130Cas)以及樁蛋白(paxillin)的去磷酸化，從而抑制癌細胞的遷移。p130Cas是局部黏著斑形成和細胞遷徙所必要的局部黏著斑復合體相關蛋白。DLC-1使p130Cas酪氨酸去磷酸化，導致肝癌細胞遷徙能力下降。同時，DLC-1表達引起FAK的去磷酸化失活，抑制了粘著斑的形成，使腫瘤細胞粘附性降低，從而誘導凋亡。以上均說明DLC-1抑制腫瘤細胞侵襲的作用可能是通過對FAK和p130Cas去磷酸化實現的。

本研究發現在卵巢上皮性癌中，DLC-1和FAK及p130Cas中的蛋白表達呈負相關。初步說明3者在卵巢癌發生發展中的重要作用。推測低表達的DLC-1通過使FAK及p130Cas去磷酸化，從而在卵巢上皮性癌的發生尤其是浸潤轉移中發揮作用。3者在卵巢癌中的表達均與淋巴結轉移有關，提示在卵巢上皮性癌細胞的浸潤和轉移中，3者可能發揮某種重要的協同作用，尚有待于進一步的研究。本研究初步確定了DLC-1和FAK及p130Cas在卵巢上皮性癌中的表達以及與各臨床病理特征之間的關系，在一定程度上揭示卵巢上皮性癌發生發展中可能存在的分子生物學機制，3者蛋白表達之間負調控的關系為抑制卵巢惡性腫瘤發展提供一個很好的理論基礎，為更好的尋求新的治療靶點提供廣闊的思路，在卵巢上皮性癌的臨床治療尤其是對腫瘤浸潤轉移的干預方面可能有潛在的臨床價值。

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