熒光原位雜交技術檢測對復發性膀胱癌的診斷價值

葛永超，馮金順，郭立恒，吳書一，袁志浩，鄭 濤，王道協

(1.鄭州市第三人民醫院 泌尿外科 河南 鄭州 450000;2.鄧州市第一人民醫院 外科 河南 鄧州474150)

尿路上皮癌尤其是膀胱癌術后復發率高，在術后隨訪中如何進行早期復發檢測是泌尿外科領域目前研究的熱點問題。2008年12月至2011年12月，對膀胱癌術后隨訪49例患者，應用熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)分析尿液遺傳學改變，探討遺傳學改變與膀胱癌復發的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經尿道膀胱腫瘤電切或者鈥激光切除術后患者49例。男27例，女12例，年齡35～75歲，中位年齡53歲。入組時隨訪3～10個月，膀胱鏡檢查未見腫瘤復發，同時尿細胞學檢查、FISH檢查均為陰性。收集20例正常人新鮮晨尿，建立FISH檢測的閾值。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 膀胱鏡、FISH技術和尿脫落細胞學方法。1.2.1 膀胱鏡檢查:由經驗和技術水平相當的醫師進行膀胱鏡檢查。

1.2.2 尿細胞學檢查:收集清晨第1次尿50 ml，尿液排出后1～2 h內涂片并立即固定，由病理科固定醫師進行。

1.2.3 FISH檢測方法:FISH技術使用的3、7、17號染色體著絲粒探針和9p21區帶探針購自北京金菩嘉醫療科技有限公司。

1.2.3.1 標本收集與處理:收集懷疑膀胱腫瘤復發患者晨尿200～300 ml，經離心、去雜質、胃蛋白酶消化、變性［(76±1)℃水浴鍋中］、雜交、洗滌、復染等試驗步驟處理。

1.2.3.2 FISH結果觀察:參照葛永超［1］方法進行。即在日本OLYMPUS-BX51熒光顯微鏡下，選用合適的濾波片觀察熒光信號和雜交效果，以細胞核中有雜交信號的細胞≥75%為有效標本，對有效標本進行計數、攝圖保存。

1.2.3.3 閾值建立和結果判定:參照葛永超［1］方法進行。對照組20例標本，按上述方法進行FISH實驗，每份標本每個探針組合計數100個膀胱上皮細胞，統計出現不同類型異常情況細胞數目、正常細胞數目的百分比，建立參考閾值，閾值=平均值+3倍標準差。檢測指標大于閾值，判定該指標陽性，小于閾值判定該指標陰性，等于閾值應加大樣本細胞計數以確定最后結果。兩種或兩種以上染色體出現異常或同一染色體出現出現兩種以上異常，提示膀胱癌細胞的存在。

1.4 統計學分析 采用SPSS13.0統計學軟件進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

本組49例患者，隨訪3～36個月，平均25.9個月。確診為膀胱癌術后復發患者31例(63.3%)。尿液細胞學檢查、FISH技術檢測、膀胱鏡檢查均未發現復發患者18例(36.7%)。31例復發患者中，尿細胞學檢測12例為陽性(敏感性為38.7%)，FISH技術檢測26例陽性(敏感性為83.9%)，敏感性明顯高于尿脫落細胞學檢查見表1。所有FISH技術和尿脫落細胞學檢查發現膀胱腫瘤患者均經膀胱鏡檢查和病理診斷證實膀胱癌復發，故FISH技術和尿脫落細胞學檢查的特異性均為100%。FISH技術檢測陽性的患者中，G3級腫瘤12例，G2級腫瘤8例，G1級腫瘤6例;尿液細胞學檢查結果發現G3級腫瘤8例，G2級腫瘤4例，無G1級腫瘤陽性病例。

表1 尿細胞學及FISH組檢測膀胱癌敏感性比較

3 討論

目前，膀胱鏡和尿脫落細胞學檢查是最常用的兩種檢測膀胱癌的手段。然而，膀胱鏡是一種有創檢查，給病人帶來一定的痛苦，而且膀胱鏡檢查的假陰性率為10%～30%［2］，傳統的尿脫落細胞學檢測雖然具有比較高的特異性，但是細胞學檢查的敏感性卻很低，尤其對低級別尿路上皮癌的檢測其敏感性更差。因此，為了更好地預測患者復發和病程進展的風險程度，更早地檢測腫瘤復發，需要敏感性更強的輔助檢測方法。近年來的分子遺傳學研究發現9號染色體的部分或全部丟失與膀胱癌的早期發生密切相關;3、7、l 7號染色體的非整倍性與膀胱癌的發展密切相關。臨床研究顯示，對尿液中脫落細胞進行以上遺傳學改變的檢測對膀胱癌的早期診斷及預后評估具有重要意義，尤其對早期尿路上皮癌患者有輔助診斷作用，其敏感性高于細胞形態學檢測，特異性則與細胞形態學檢查相當［1，3］。

目前，針對以上所述的遺傳學改變而建立的檢測方法，即FISH技術，逐漸被歐美國家用于膀胱尿路上皮癌的早期診斷及術后監測。目前，FISH技術已經被美國FDA批準用于臨床膀胱癌早期檢測及預后監測。Kipp［4］采用該方法監測膀胱癌的復發，37例表淺性膀胱癌接受BCG膀胱內灌注后，12例FISH結果陽性的患者均有腫瘤復發，認為多色FISH可作為監測膀胱癌腔內灌注治療后復發的一種有效方法。Fdedrich［5］比較了多色FISH、BTA stat、NMP22等方法，認為三者敏感性相似，但特異性上多色FISH明顯高于其他兩種方法，且不受血尿、尿路感染及膀胱內灌注等影響。本組復發的膀胱癌患者敏感性為83.9%，而尿細胞學檢查的敏感性為38.7%，FISH技術檢測膀胱癌與尿細胞學檢查的敏感性差異有統計學意義。

FISH的一個重要特征是在膀胱鏡診斷膀胱癌復發之前已檢測出陽性結果。國外學者研究發現，FISH陽性常較膀胱鏡出現異常提前平均約6個月［6］。Zell-weger等［7］報道FISH檢查陽性組患者在中位為20.4個月的隨訪時間內出現膀胱癌復發的發生率是39%，而FISH檢查陰性組復發率是21%。Sarosdy等［6］報道了36例膀胱鏡檢查陰性而FISH陽性者，在隨訪3～16個月(平均6個月)有15例(42%)確診為膀胱癌，而68例膀胱鏡檢查陰性、FISH陰性在隨訪3～19個月(平均11.2個月)只有13例(19%)確診為膀胱癌。于是Sarosdy提出一個術語“預期陽性”來反映一個事實，即FISH能在膀胱鏡發現可見腫瘤之前發現幾乎一半復發膀胱癌。Yoder等［8］隨訪了250例膀胱癌術后患者，發現211例膀胱鏡陰性的患者中，有56例FISH陽性，即約27%的患者出現預測陽性，其中35例(62.5%)出現復發。本組患者在FISH檢測陽性后的6～24個月均出現腫瘤復發，預測陽性率達到100%，較國外觀察結果高，可能是由于觀察病例少，病例偶然過于集中有關。但是，FISH技術對于監測膀胱癌術后復發的敏感性達到83.8%，較尿細胞學檢查高，是膀胱癌復發的有效檢測方法。

［1］ 葛永超，吳書一，馮金順，等.熒光原位雜交技術檢測尿液脫落上皮細胞染色體畸變對膀胱癌的診斷價值［J］.中國實用醫刊，2011，38(1):4-9.

［2］ Hungerhuber E，Stepp H，Kriegmair M，et al.Seven years experience with 5-amin olevulinic acid in detection of transitional cell carcinoma of the bladder［J］.Urology，2007，69(2):260-264.

［3］ Hajdinjak T.UroVysion FISH test for detecting urothelial cancers: Meta-analysis of diagnostic accuracy and comparison with urinary cytology testing［J］.Urol Oncol，2008，26(6):646-651.

［4］ Kipp B R，Karnes R J，Brankley S M，et a1.Monitoring intravesical therampy for supericial bladder cancer using fluorescence in situ hybridization［J］.J Urol，2005，173(2):40l-404.

［5］ Friedrich M G，Toma M I，Hellstern A，et a1.Comparison of multitarget fluorescence in situ hybridization in urinne with other noninvasive tests for detecting bladder cancer［J］.BJU Int，2003，92(9): 911-914.

［6］ Sarosdy M F，Schellhammer P，Bokinsky G，et al.Clinical evaluation of a multi-target fluorescent in situ hybridization assay for detection of bladder cancer［J］.J Urol，2002，168(5):1950-1954.

［7］ Zellweger T，Benz G，Cathomas G，et al.Multi-target fluorescence in situ hybridization in bladder washings for prediction of recurrent bladder cancer［J］.Int J Cancer，2006，119(7):1660-1665.

［8］ Yoder B J，Skacel M，Hedgepeth R，et a1.Reflex UroVysion testing of bladder cancer surveillance patients with equivocal or negative urine cytology:a prospective study with focus on the naturahistory of anticipatory positive findings［J］.Am J Clin Pathol，2007，127(2): 295-301.