里氏木霉HC－415菌液體發酵產纖維素酶時形態學變化研究＊

劉 斌，譚 宏，紀鴻雁

（湖南大學生物學院湖南長沙，410082）

纖維素物質是地球上最豐富的有機物資源，全球每年產生的纖維素高達1 000億噸，但這些資源大部分利用率很低，且污染環境.如能借助纖維素酶將纖維素降解并進一步轉化為乙醇、細胞蛋白及氣體燃料等物質，對于解決全球面臨的能源危機、食品短缺及環境污染等問題具有重大的意義.此外，纖維素酶還可廣泛應用于醫藥、飼料、果蔬加工、造紙、中草藥制造、石油開采、工業洗滌劑、細胞生物工程等行業［1］.

纖維素酶目前主要通過木霉以固體、液體深層發酵方式發酵生產.在固體發酵中，生長狀況及產酶峰期可以通過固體曲的干濕度、菌絲生長及分布狀況、分生孢子的形成及顏色變化等因素直觀辨別［2－3］.在液體深層發酵中一般通過測定酶活性來確定產酶高峰期，然而這種傳統的酶活性測定方法不僅需要多種專用儀器設備和化學試劑，還要結合對比標準曲線和計算，不僅費事費力，而且檢測成本相應增高［4－5］.因此，研究液體深層發酵中的產酶菌株形態學變化，建立其形態學指標體系，對于快速掌握發酵產酶的高峰期和調控發酵液的成熟度具有重要意義.本文以里氏木酶HC－415菌為研究材料，對該菌在液體深層發酵產酶時的菌絲體形態特征與纖維素酶活力間的相關性進行了研究，初步掌握了該菌液體發酵產纖維素酶時菌體形態學變化動態規律，現將結果報道如下.

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料與試劑

里氏木霉（Trichoderma reesei）HC－415，湖南大學生物學院提供.菌種，稻草，豆粕，麩皮，羧甲基纖維素鈉，新華1號濾紙等.

1.2 儀器設備

30L規模發酵罐出處，倒置熒光顯微鏡等.

2 培養基

斜面種培養基：PDA培養基；一級種培養基：麩皮，葡萄糖等，pH 5.5－6.0；二級產酶培養基：稻草，豆粕等，pH 5.5－6.0.

3 實驗方法

3.1 纖維素酶液體深層發酵法

將HC－415菌斜面種的孢子液接入一級種培養基，28～30℃旋轉式搖床上培養40h，再接入30L規模罐二級產酶培養基中進行液體深層產酶發酵試驗.

3.2 纖維素酶活性測定方法

羧甲基纖維素酶（CMCase）活性測定：DNS法.濾紙糖酶（FPAase）活性測定：參照文獻［4－5］，在1mL適當稀釋的酶液中加入1mL 0.05mol·L－1（pH 4.6）緩沖液和1條1＊6cm2新華1號濾紙.50℃酶解60min，加3mL DNS試劑.沸水浴10min，測還原糖，扣除空白后計算酶活性.

酶液酶活性單位規定為：1h水解生成1mg葡萄糖的酶量為1個活性單位（U）.

3.3 纖維素酶液的制備

采集的發酵液，離心除去稻草等固形物，上清液即為酶粗提取液，粗酶液應立即進行后續處理，否則，應放入4℃冰箱保存.

3.4 菌體形態觀察

將含HC－415菌絲體的發酵液涂于載玻片上，滴加清水，或用乳酸石炭酸棉藍染色液對菌體染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察菌絲體形態并拍照記錄.

4 結果與討論

4.1 30L規模罐中HC－415菌產纖維素酶發酵過程動態變化

30L發酵罐裝液量20L，攪拌速度為200～450 r／min，通氣量0.25～0.6L／（min·L），發酵溫度30±1℃，罐壓0.01～0.03MPa，消泡劑聚醚添加量為0.6%，培養144h.發酵過程中間隔2h測定并記錄pH、通氣量、溫度、攪拌速度、泡沫等的變化；每隔12h取樣檢測酶活性，觀察記錄菌體的形態學變化.從pH檢測結果可以看出：菌液pH值在考察的時間內（0～132h）隨著發酵時間的延長逐漸升高，從初始的pH值4.20升高至4.94.酶活性檢測結果發現：前24h內CMC酶和FPA酶活性很低，基本處于停滯期，60h之后酶活性快速增長，在120 h左右這兩種酶活性均達到高峰，120～132h酶活性處于高峰穩定期，132h后酶活性逐步降低（圖1），該結果與以前報道的結果類似［6］.

圖1 產纖維素酶菌HC－415液體發酵時的CMC和FPA酶活性動態變化曲線Fig.1 The kinetic curves of CMCase（a）and FPAase（b）activity during the cellulase liquid fermentation by HC－415strain

4.2 發酵產酶第Ⅰ期菌體形態學及酶活性變化

根據取樣觀察的結果發現：HC－415菌在液體發酵產纖維素酶時的形態學變化可以明顯的劃分為4個時期，第Ⅰ期為接種后的0～24h區間，此時的CMC酶和FPA酶活性很低，CMC酶活性約為5 U，FPA酶活性約為0.5U（圖1）.12h取樣觀察，HC－415菌呈圓形、桿狀小體分布（圖2），發酵至24 hr時，HC－415菌已由短圓小體形成細長的團狀菌絲體（圖3），表明此階段HC－415菌主要為絲狀營養生長，較少分枝，產酶基本處于停滯期.

圖2 發酵12h的HC－415菌呈小圓桿狀10×20Fig.2 The small rod HC－415hypha after fermentation for 12h（10×20）

圖3 發酵24h的HC－415菌絲團10×10Fig.3 The HC－415mycelium after fermentation for 24h（10×10）

4.3 發酵產酶第Ⅱ期菌體形態學及酶活性變化

形態第Ⅱ期變化為接種后的24～60h區間，此時的HC－415菌絲體不斷伸長，分枝增多，菌絲體變粗（圖4，圖5），此期CMC酶和FPA酶活性增長明顯（圖1），CMC酶活性可增長至20U左右，較Ⅰ期增強約4倍；FPA酶活性可增長至5U左右，較Ⅰ期增強約10倍.

圖4 發酵36h的HC－415菌10×10Fig.4 The HC－415mycelium after fermentation for 36h（10×10）

圖5 發酵48h的HC－415菌分枝10×20Fig.5 The branched mycelium of HC－415 after fermentation for 48h（10×20）

4.4 發酵第Ⅲ期菌體形態學及酶活性變化

菌體形態第Ⅲ期變化約在接種后的60～132h區間，此階段的HC－415菌絲體雖然較長，但已不再增長，開始出現橫隔（圖6），菌絲體變粗變短，在分枝頂部生出許多膨大的結節（圖7～圖8），至120h左右時，菌絲體斷裂形成緊密相連的膨大圓形結節（圖9），這段時期為發酵液中纖維素酶活力的快速增長期和產酶高峰穩定期（圖1）.CMC酶活性在此區間內有2個明顯的產酶高峰期，第1個約在72h左右，酶活性可達55U，較Ⅰ期增強約11倍，第2個產酶高峰期約在120h左右，酶活性可達70U，較Ⅰ期增強約14倍；FPA酶活性在此區間則呈穩步快速增長態勢，至120h左右到達產酶高峰穩定期，酶活性可達12U左右，較Ⅰ期增強約24倍.這種形態學特征與所對應的酶活性的相關性得到多次實驗結果驗證［7－8］，可以作為快速掌握產酶高峰期發酵液成熟度的重要形態學指標.然而里氏木霉在產酶高峰期菌絲體變短變粗，并在頂部生出許多膨大結節的現象未見有報道，這些結節究竟是產酶結構、繁殖結構（分節孢子）或是休眠結構（厚垣孢子）尚有待進一步研究.

圖6 發酵60h的HC－415菌10×20Fig.6 The mycelium of HC－415after fermentation for 60h（10×20）

圖7 發酵72h的HC－415菌頂端膨大結節10×40Fig.7 The enlargement top nodules of HC－415 after fermentation for 72h（10×40）

圖8 發酵96h的HC－415菌頂端膨大結節10×40Fig.8 The enlargement top nodules of HC－415 after fermentation for 96h（10×40）

圖9 發酵120h的HC－415菌10×40Fig.9 The HC－415mycelium after fermentation for 120h（10×40）

4.5 發酵后期菌體形態學及酶活性變化

發酵至132h后，HC－415菌絲體形態變化進入第Ⅳ期，此期間菌絲體雖呈粗短圓狀，頂部仍有許多膨大結節，但菌體的數量開始逐漸變少（圖10），從此時起CMC酶和FPA酶活性逐漸步下降.原因可能是隨著發酵液中產生的纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶等濃度的增高，HC－415菌絲體的合成受到抑制并被分解；另外，隨著發酵時間延長和發酵液pH值升高，菌絲體出現衰老、自溶，導致菌體的數量逐漸變少；由于營養源的減少和纖維素酶自身的阻遏抑制效應，加上菌體數量的減少導致了CMC酶和FPA酶活性逐漸下降［9］.

圖10 發酵132h后逐漸變少的HC－415菌10×40Fig.10 The decreased number of HC－415mycelium after fermentation for 132h（10×40）

綜上所述，里氏木霉液體發酵產纖維素酶時，菌體形態變化與發酵液中的酶活性高低有著密切的關聯性，這種關聯性可作為快速調控發酵液成熟度的重要指標，利用顯微鏡觀察菌體形態作為直接快速判斷該菌產酶能力的強弱具備可行性.HC－415菌絲體在產酶高峰期變短、變粗，并在分枝頂部生出許多的膨大結節究竟是產酶結構、繁殖結構（分節孢子）或是休眠結構（厚垣孢子）尚有待進一步研究.

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