IT－ISJ標記及其在大麥遺傳多樣性研究中的應用

余春磊劉家嫻，2齊國昌羅小嬌劉新春馮宗云*

(1.四川農業(yè)大學農學院植物遺傳育種學系大麥研究中心，四川溫江611130; 2.四川甘孜藏族自治州農業(yè)科學研究所，四川康定626000)

IT－ISJ標記及其在大麥遺傳多樣性研究中的應用

余春磊1劉家嫻1，2齊國昌1羅小嬌1劉新春1馮宗云1*

(1.四川農業(yè)大學農學院植物遺傳育種學系大麥研究中心，四川溫江611130; 2.四川甘孜藏族自治州農業(yè)科學研究所，四川康定626000)

本研究首次利用一種新的分子標記IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction，內含子－外顯子拼接位點)對34份來自中國青藏高原、歐洲和北美的栽培青稞品種(系)進行了多態(tài)性分析。結果表明:20對引物組合共擴增出87條條帶，平均每對引物組合4.35條條帶。其中81條具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶為93.10%。共擴增出134個等位變異，變幅為2～11個，平均每個引物對檢測到6.7個。34份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅在0.437～0.931之間，平均為0.743±0.094。材料間平均遺傳距離較低，僅為0.257，遺傳多樣性在0.2509～0.8460之間，平均為0.59。本結果表明IT－ISJ標記能有效用于大麥遺傳多樣性分析、品種鑒定，遺傳圖譜構建及分子標記輔助選擇育種中。因此，大麥育種者在雜交育種中應廣泛發(fā)現(xiàn)和挖掘優(yōu)異青稞資源，擴大青稞種質的遺傳基礎，提高青稞育種效率。

大麥;青稞;IT－ISJ;遺傳多樣性

大麥(Hordeumvulgare L.)是世界上最古老的栽培作物之一，具有早熟、抗逆性強、適應性廣等特性，主要用作牲畜飼料、啤酒工業(yè)原料，還具有釀造、美容、食用、保健等多種用途，已受到大麥育種者及食品加工企業(yè)的高度關注。多種分子標記的開發(fā)，有利于大麥高密度分子遺傳圖譜的構建、基因定位、QTL作圖、遺傳多樣性評價、標記輔助選擇育種及品種鑒定等研究。在大麥上，應用較多的分子標記包括RAPD、RFLP、SSR、AFLP等，SRAP應用較少［1，9］。但這些分子標記各有其優(yōu)缺點。尋找設計引物簡單，操作簡便，穩(wěn)定性高的新標記是大麥育種及分子生物學者努力追求的目標。

IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction，內含子－外顯子拼接位點)標記是鄭靚等(2008)［2］根據(jù)植物基因內含子剪接位點保守序列參照Weining and Langridge(1991)［8］的方法設計合成的。具體為前引物的核心部分為5’端剪接位點保守序列CAGGTAACT，并在其5’端和3’端分別加上限制性內切酶SPhl的識別序列GCATGC和3個選擇性堿基。后引物的核心部分為3’端剪接位點保守序列ACCTGCA，并在其5’端和3’端分別加上限制性內切酶EcoRI的識別序列GAATTC和任意3個選擇堿基。此標記已在棉花［2］、花生［3］、蘋果［4］中應用于品種鑒定、構建遺傳圖譜、遺傳多樣性分析，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點。但該標記應用于大麥上尚未見報道。

本研究以栽培青稞品種(系)為材料，采用IT－ISJ標記技術分析了該標記在大麥中應用的可行性，并評價了這些材料間的遺傳關系，可為大麥育種、品種鑒定、新品種保護與利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

供試材料共34份，包括西藏材料9份(XZ1－XZ9)、甘肅材料5份(GS1－GS5)、四川材料5份(SC1－SC5)及9份青海材料(QH1－QH9)和6份國外材料(AB1－AB6)。其名稱及來源見表1。這些材料現(xiàn)保存于四川農業(yè)大學大麥研究中心。

1.2方法

1.2.1 gDNA的提取。gDNA提取采用CTAB法［6］。每份材料取新鮮健康的幼葉約300 mg，置于液氮中迅速研磨至粉末，隨后將粉末轉移到2 ml離心管中，加入800μL65℃預熱的2× CTAB提取液［0.2 mmol/L Tris－HCL(PH約8.0)，0.02 mmol/L EDTA，55 mmol/L CTAB，2%β－巰基乙醇)］于65℃水浴至少50 min，期間輕輕顛倒混勻幾次，取出離心管冷卻至室溫，然后加入800μL氯仿:異戊醇(24:1)輕搖10 min后靜置30 min，11 000 r/min離心15 min，取上清液加入等體積的異丙醇沉淀DNA，用70%乙醇沖洗2次，90%乙醇再沖洗1次，干燥后加入50μl滅菌的ddH2O，用紫外分光光度計檢測其濃度與質量。將DNA稀釋至20 ng/μL于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 IT－ISJ反應體系。PCR引物(表2)采用鄭靚等［2］已發(fā)表的引物，由上海英捷貿易有限公司合成。引物組合以正反向引物名稱的最后兩個字母組合表示。PCR擴增通過正交試驗設計選出最佳體系，總體積20μL，包括20 ng/μL模板DNA 2μL，1.5 mmol/L的MgCl2，0.2 mmol/L的dNTPs，0.5μmol/L引物，1U Taq聚合酶，2μL 10×PCR buffer。在PTC－200擴增儀上完成。反應程序為:94℃預變性5 min，94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸lmin，40個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 供試栽培青稞品種(系)名稱、編號及來源

表2 IT－ISJ引物名稱及核苷酸序列

1.2.3擴增產(chǎn)物的檢測。擴增產(chǎn)物加3×Loading-Buffer 10μL，95℃變性5 min后，用預熱30 min的8%變性聚丙烯酰胺凝膠恒功率75 w電泳，至指示劑離膠板底部三分之一處(約45 min)，取下膠板。采用銀染法檢測［5］。用數(shù)碼相機拍照，統(tǒng)計帶型。

1.2.4數(shù)據(jù)的處理。對IT－ISJ擴增產(chǎn)物的電泳結果采用0、1、－9統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫，在相同遷移位置有帶記為1，無帶記為0，模糊不清或其他原因記為－9。遺傳多樣性指數(shù)(H)按H=1－∑Pi2(Nei等，1979)［7］計算，其中Pi為某座位第i個等位變異的頻率。利用NTSYS－pc統(tǒng)計分析軟件計算遺傳相似系數(shù)(GS)。計算公式為:GS= 2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij為材料i和j共有的擴增片段數(shù)，Ni為材料i中出現(xiàn)的擴增片段數(shù)，Nj為材料j中出現(xiàn)的擴增片段數(shù)。

2結果與分析

2.1引物組合篩選

用10個正向引物和12個反向引物組成的120對引物組合，對選取的兩個品種(北青2號、北青3號)進行多態(tài)性篩選，其中74對引物能擴增出條帶，占引物組合總數(shù)的61.67%。有55對引物組合能擴增出多態(tài)性，多態(tài)性比例占45.83%。并用相同引物對和模板進行多次擴增和電泳，其帶型沒有變化，表明IT－ISJ標記在大麥上具有較好的重現(xiàn)性。從這55對引物中選取擴增性較好、重復性較高的20對引物對所有材料進行多態(tài)性分析，統(tǒng)計在100～2 000 bp之間能夠清晰可辨的電泳條帶。其中，引物組合IT－ISJ02F47R可區(qū)分11個品種，而引物組合IT－ISJ08F52R、ITISJ08F54R、IT－ISJ08F55R和IT－ISJ11F54R各自能區(qū)分10個品種。特別是可用5個引物組合(IT－ISJ02F08R、IT－ISJ02F42R、IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R)就能將本試驗中的34份材料區(qū)分開，占引物組合總數(shù)的25.00%。

2.2多態(tài)性分析

圖1為引物組合IT－ISJ05F18R擴增產(chǎn)物部分電泳圖。發(fā)現(xiàn)不同的引物對擴增的條帶數(shù)、擴增帶型都不同(表3)。從表3看出，在總樣本中，20對引物組合共產(chǎn)生清晰可辨的條帶數(shù)為1～8條，大部分在4條以上，總計87條，平均每個引物對4.35條，其中81條具有多態(tài)性，平均多態(tài)性條帶為4.05條，多態(tài)性條帶為93.10%。在這20對引物中，3個引物對IT－ISJ02F18R、ITISJ11F46R、IT－ISJ05F18R的多態(tài)性條帶比率分別為50.00%、60.00%、71.42%，其余17對引物的多態(tài)性條帶比率為100%。這表明IT－ISJ標記適合于對大麥進行DNA多態(tài)性分析。

圖1 引物組合IT－ISJ05F18R擴增產(chǎn)物部分電泳圖(M:DL2000;1:喜馬拉雅2號;2:喜馬拉雅4號; 3:喜馬拉雅5號;4:喜馬拉雅6號;5:喜馬拉雅10號; 6:喜馬拉雅16號;7:喜馬拉雅17號;8:喜馬拉雅19號;9:喜馬拉雅22號;10:甘青4號;11:甘青5號; 12:9619;13:9640;14:9718;15:白六棱)

2.3等位變異與遺傳相似性

從表3可知，20對引物共擴增出134個等位變異(帶型)，變幅在2～11個，平均每個引物對檢測到6.70個。34份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅在0.437～0.931之間，平均為0.743± 0.094。其中，l來自墨西哥的CI－424(AB4)和北青3號系選的SC5間相似系數(shù)最小(0.436)，而北青1號(QH2)和北青2號(QH3)間相似系數(shù)最大，達0.931。供試材料中，相似系數(shù)＜0.75的材料組合有238個，占組合總數(shù)的42.42%，相似系數(shù)＞0.75的材料組合有323個，占所有供試組合的57.58%。材料間平均遺傳距離較低，僅為0.257，遺傳多樣性在0.2509～0.8460之間，平均為0.59。這表明供試材料間的遺傳差異較小。

表3 IT－ISJ引物組合的多態(tài)性與等位變異

3討論與小結

IT－ISJ(intron targe red intron－exon splice junction，內含子－外顯子拼接位點)DNA分子標記技術是近年來由鄭靚等(2008)［2］開發(fā)出的，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、引物設計簡便、操作簡單、成本低等優(yōu)點，已在陸地棉［2］、花生［3］、蘋果［4］上有報道。但該標記應用于大麥上還未見報道。在本研究中，我們首次用IT－ISJ的10個正向引物和12個反向引物組成120對引物，對選取的2個青稞品種(北青2號、北青3號)進行了引物對的篩選。篩選出多態(tài)性較高、帶型豐富、條帶清晰的引物組合55個，占引物組合總數(shù)的45.83%，遠高于紀君超等(2010)［4］在加工蘋果品種中報道的結果。從55對引物組合中選取20對引物組合對34份青稞品種(系)進行了多態(tài)性分析，共擴增出87條帶，其中多態(tài)性帶81條，平均每對引物組合擴增出4.05條帶，多態(tài)性百分率為93.10%。而多態(tài)性高達100%的引物組合數(shù)達17個，占85.00%，明顯高于鄭靚等(2008)［2］在陸地棉、于樹濤等(2009)［3］在花生上及紀君超等(2010)［4］在蘋果中所得結果。在這20對引物中，3個引物對IT－ISJ02F18R、IT－ISJ11F46R、ITISJ05F18R的多態(tài)性條帶比率分別為50.00%、60%、71.42%。從圖1和表3看出，不同的引物對擴增的條帶數(shù)、擴增帶型都不同。引物組合IT－ISJ02F47R可區(qū)分11個品種，而引物組合ITISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R和IT－ISJ11F54R各自能區(qū)分10個品種。特別是僅用5個引物組合(IT－ISJ02F08R、IT－ISJ02F42R、IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R)就能將本試驗中的34份材料區(qū)分開，占引物組合總數(shù)的25.00%。上述結果表明，采用IT－ISJ引物組合對青稞品種(系)能擴增得到條帶清晰、穩(wěn)定性較好、多態(tài)性較高的條帶、且操作簡單、成本較低，這表明IT－ISJ標記應用在大麥上是可行的，將在大麥遺傳多樣性分析、品種鑒定，遺傳圖譜構建及分子標記輔助選擇育種中得到廣泛的應用。

34份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅在0.437～0.931之間，平均為0.743±0.094。供試材料中，相似系數(shù)＜0.75的材料組合有238個，占組合總數(shù)的42.42%，相似系數(shù)＞0.75的材料組合有323個，占所有供試組合的57.58%。材料間平均遺傳距離僅為0.257，平均遺傳多樣性為0.59。這表明供試材料間的遺傳差異較小，遺傳基礎較窄，遺傳關系較近。因此，大麥育種者在雜交育種中應廣泛發(fā)現(xiàn)和挖掘優(yōu)異青稞資源，擴大青稞種質的遺傳基礎，提高青稞育種效率。

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IT－ISJM arkers and Its Application to the Genetic Diversity in Barley

YU Chun－Lei1，LIU Jia－Xian1，2，QIGuo－Chang1，LUO Xiao－Jiao1，LIU Xin－Chun1，F(xiàn)ENG Zong－Yun1
(1．Barley Research Centre，Department of Plant Genetics and Breeding，College of Agronomy，Chengdu Campus，Sichuan Agricultural University，Wenjiang 611130，China;2．Ganzi Institute of Agricultural Sciences，Cangding 626000，China)

IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction)，a new molecularmarker，themolecular polymorphism of 34 cultivated hulless barley cultivars(lines)from the Qinghai－Tibet Plateau of China，the Europe and the North America，which was reported firstly in this study．The result showed that，20 primer combinations produced a total of87 clear bandswith an average of4．35 bands per primer pair，and which 81bands(93．10%)were polymorphic．134 alleles，ranged from 2 to 11，were amplified with an average of 6．7 alleles per primer pair．Genetic similarities ranged from 0．437 to 0．931，with an average of 0．743．The average genetic distance(0．257)was lower among accessions and average genetic diversity(0．59)，so the result indicated that the genetic basis is narrower among accessions．Based on the results，IT－ISJmarker could be effectively used in researching genetic diversities，cultivar identifications，construction of geneticmap and molecularmarker－assisted selection breeding．Therefore，it is very essential that the excellent hulless barley genetic resources should be extensively discovered and excavated to widen the genetic basis of hulless barley genetic resources and increase the efficiency in hulless barley breeding．

Barley;Hulless Barley;IT－ISJMarker;Genetic Diversity

2012－11－11

現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設基金(CARS－05)、四川省教育廳重點項目、四川農業(yè)大學科技成果轉化專項基金。

同等貢獻作者簡介:余春磊(1989－)，男，在讀碩士生，主要從事大麥育種與分子生物學研究。

劉家嫻(1983－)，女，農業(yè)推廣碩士，助理農藝師，主要從事青稞栽培與育種研究工作。

*通訊作者:馮宗云(1963－)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事大麥遺傳育種及分子生物學研究。