新一代組織工程細胞支架的研究進展

李志義 丁兆紅 劉志軍

新一代組織工程細胞支架的研究進展

李志義 丁兆紅 劉志軍

細胞支架是構建組織工程器官或組織的重要基礎。在短短幾十年內，細胞支架的研究與開發已取得了重大進展，促進了細胞支架從第一、二代向第三代發展。本文概述了第三代細胞支架的主要特征；介紹了細胞支架制備技術的最新進展，特別介紹了用超臨界反溶劑（SAS）工藝制備第三代細胞支架的特點、優勢及技術關鍵；指出了開發第三代細胞支架的重要途徑之一：利用SAS工藝將天然、合成高分子材料與生物活性材料這三類材料進行復合，制備性能可調、綜合性能優良的細胞支架；并提出了按此途徑尚需開展的主要研究內容和要達到的主要目標。

組織工程細胞支架超臨界反溶劑工藝

1987年，組織工程的先驅，哈佛醫學院外科醫師Joseph Vacanti和MIT生物醫學工程師Robert Langer在華盛頓召開的美國自然科學安全會議上首次系統地描述了組織工程的概念[1-2]，并將組織工程定義為：應用工程和生命科學原理來開發生物替代品，用以修復、維持和改進組織或器官功能[3]。隨著生物醫學工程的發展以及細胞治療的出現，組織工程得到了迅速發展，已成為再生醫學的一個分支。

盡管組織工程在臨床應用上還面臨諸多挑戰[4]，但在骨、軟骨、血管、皮膚等方面的研究已取得了重大進展，而且骨和皮膚組織工程已開始臨床應用研究[5]。隨著組織工程產品進入市場和臨床試驗，所用生物材料的銷售額已超過了2.4億美元/年[6]。

細胞支架、種子細胞和生長因子（或生物反應器）是組織工程的三大要素[7]。其中，細胞支架是基礎。它為種子細胞和生長因子提供了適宜的微環境，完成組織或器官的再生過程。因此，細胞支架，特別是三維細胞支架的研究一直是組織工程的熱點[5]。本文對組織工程細胞支架的研究開發新趨勢及新途徑作一簡介。

1 新一代組織工程細胞支架的特征

細胞支架用生物材料經歷了第一代與第二代發展[8-9]。第一代是生物“惰性”材料。其特征是具有良好的物理性能（強度和耐腐蝕性等），植入體內后排異反應較小[10]。可供臨床使用的典型生物惰性材料是金屬（貴金屬和合金等），但其主要缺點是，因其剛性與強度與被替代組織差異很大，植入體內后會因應力遮擋導致界面附近組織萎縮[11]。

第二代細胞支架用生物材料是生物“活性”或生物可吸收材料[12]。其特征是，能在生理環境中產生一系列表面反應和生物響應[13]，故具有骨傳導、骨誘導和骨生成作用[7]。典型的生物活性材料是生物活性玻璃和玻璃陶瓷[11]。它們都能與骨骼形成骨鍵結合，主要由Na2O-CaO-MgO-P2O5-SiO2體系組成，與骨骼形成骨鍵結合的速度主要取決于各個組分[14]。羥基磷灰石（HA）是人體骨的礦物相，具有良好的生物活性和骨傳導性，因而在骨細胞支架制備中得到了廣泛關注[15]。然而，近來的研究表明，生物活性玻璃（代號為45S5）作為骨細胞支架在促進新骨和血管形成等方面更為優越[16-17]。

生物活性玻璃植入人體內后會發生如下表面反應和細胞活動[18]：第1、2步，形成SiOH鍵并釋放Si(OH)4；第3步，形成水合二氧化硅層；第4步，形成無定形Ca+PO2+CO3層；第5步，形成羥基磷灰石（HA）層；第6步，生長因子在HA層吸附；第7步，巨噬細胞作用；第8步，成骨細胞附著；第9步，成骨細胞繁殖與分化；第10步，細胞間質基質產生；第11步，細胞間質基質礦化生成新骨。前5步表面反應進行得非常迅速，在24 h內就能完成[13]。表面反應大大強化了骨的鍵合與形成作用。研究表明，這種強化作用與調節誘發細胞周期開始和進程的基因直接相關[11]。骨前細胞周期調控的結果，使成骨細胞快速繁殖和分裂，從而導致骨的迅速再生[19-20]。生物活性玻璃已在臨床得到應用，對其應用前景，Hench等[8]認為，如果能用玻璃激活基因，可以肯定，將來就能用它控制基因，使組織始終保持健康狀態。

典型的生物可吸收材料是生物可降解的高分子聚合物，分天然的和合成的兩大類。可用于細胞支架的天然高分子材料有3類[21]：多聚糖類、蛋白類和微生物來源聚脂類。多聚糖類包括殼聚糖、透明膠質酸、藻酸鹽類、淀粉、細胞膜質、右旋糖酐等；蛋白類包括膠原蛋白、絲素蛋白、纖維蛋白凝膠等；微生物來源聚脂類包括聚羥基脂肪酸脂、聚3-羥基丁酸脂和聚4-羥基丁酸脂等。天然高聚物具有可降解性，且毒性低、來源豐富。但也存在一些缺點：溶解或降解太快、生物性能不穩定、免疫排斥及傳染疾病等。

殼聚糖是自然界中唯一的陽性線性多糖，無毒、無刺激性。由于是弱堿性，與人體相容性良好，且具有較好的生物降解性和滅菌作用。殼聚糖具有親水性表面，有利于細胞的附著、繁殖與分化。但其力學性能和穩定性差，不容易保持預定形態[22]。

淀粉是一種可再生的天然高分子材料，其分子式為(C6H10O5)n，具有獨特的化學和物理性能以及營養功能。淀粉及其水解產品是人類膳食中可消化的碳水化合物。由于它可生物降解、穩定性和生物相容性好、安全、無毒，并具有獨特的生物功能性等，在生物醫學領域具有廣闊的應用前景[23]，在骨細胞支架制備中也受到廣泛重視[5]。

可用于細胞支架材料的合成生物可降解聚合物有聚乳酸（PLA）、聚己內酯（PCL）、聚乙醇乙酸（PGA）、PLA與PGA的聚合物（PLGA）、聚羥基丁酸戊酸脂（PHBV）、聚胺基甲酸脂（PU）等。PLA有聚左旋乳酸（PLLA）、聚右旋乳酸（PDLA）和聚消旋乳酸（PDLLA）3種構型。PDLA為非晶態，機械強度較差，一般不用作細胞支架材料。除它之外的上述合成生物可降解聚合物都具有較好的機械強度、生物降解性和生物相容性，但它們親水性較差，細胞黏附力弱，不利于細胞的附著與生長[5]。

為改善天然和合成高分子聚合物單獨用于細胞支架時的親水性、降解性、穩定性、力學性能以及細胞相容性等，將兩種材料復合使用可以達到良好效果。例如，將淀粉與PCL復合[24-25]、與PLA復合[26-27]、與聚乙烯醇復合[28-29]等，將殼聚糖與PLA復合[30-32]、與PCL復合[33-35]、與PLGA復合[36]等。這些復合材料，不僅可以改善細胞支架性能，而且還可以通過調節復合材料的比例，有目的地調控細胞支架性能。

第二代細胞支架用生物材料的缺點是，具有生物活性的材料，缺乏生物可吸收性；而具有生物可吸收性的材料，則不具備生物活性[8]。

新一代（第三代）細胞支架用生物材料是既具有生物活性又具有生物可吸收性的材料[8]。其特征是，具有與新組織生成速度相匹配的被吸收速度，同時能在分子生物學水平上對細胞或基團的作用進行調控。開發新一代細胞支架用生物材料的基本途徑是，在第二代生物材料的基礎上，使生物可吸收的材料具有生物活性，或者使具有生物活性的材料具有生物可吸收性。

進入21世紀以來，人們將研究重點移至開發新一代細胞支架等材料上，基本途徑是以生物可吸收的材料為基體，通過復合或表面修飾的方式對生物活性材料進行改性。例如，You等[37]、Salerna等[38]和Raussi等[39]分別用溶膠—凝膠、超臨界流體發泡和濕化學法制得了PCL/HA復合支架，Jack等[40]用熱誘導相分離法制得了PHBV/HA復合支架，EI-Kady等[41]和Hong等[42]分別用冷凍萃取法和熱誘導相分離法制得了PLLA/45S5復合支架，Yun等[43]用溶膠—凝膠與氣化誘導自組裝相結合的方法制得了PCL/45S5復合支架，Chen等[44]用鹽粒子瀝濾法制得了PDLLA/HA復合支架，Helen等[45]用熱誘導相分離法制得了PDLLA/45S5復合支架，Rszkowska等[46]用鹽粒子瀝濾法制得了PV/45S5復合支架。Rezwan等[47]對復合支架研究進展進行綜述，討論的生物可降解材料主要有PDLLA、PLLA、PCL、PGL和PHBV等，涉及的生物活性材料主要有生物活性玻璃、玻璃陶瓷以及羥基磷灰石等，涉及的制備方法主要有熱誘導相分離法、鹽粒子瀝濾法、微球燒結法和固體自由成型技術等。

2 組織工程細胞支架制備新技術

除了上述的溶膠—凝膠法、氣體發泡法、濕化學法、熱誘導相分離法、冷凍萃取法、氣化誘導自組裝法、鹽粒子瀝濾法、微球燒結法和固體自由成型法等外，目前用來制備細胞支架的方法還有熔融成型法、纖維黏結法、電紡絲法等，以及在這些方法的基礎上發展的一些復合技術（例如相分離/粒子瀝濾、粒子瀝濾/冷凍干燥、電紡絲/粒子瀝濾/氣體發泡工藝等）和新型快速成型工藝等[5，47]。

盡管這些方法各有特點和優越性，但有些問題仍然是制約其應用的關鍵。例如，這些方法大都涉及有機溶劑，再對其進行脫除，而殘留有機溶劑達到臨床應用可接受的范圍就成為一個難題；有些方法涉及高溫，不利于制備過程中生物活性物質的引入；有些方法形成的孔隙率低，孔與孔之間相互貫通差；有些方法無法實現對孔徑的控制，孔結構及其強度較差；有些方法工藝復雜，在實驗室完成一個制備過程需很長時間（例如澆鑄/粒子瀝濾工藝需要7 d）等。

將超臨界流體引入組織工程細胞支架的制備，已經引起了較多關注[48]。目前已在兩個方面取得了可喜進展，一是將超臨界二氧化碳（ScCO2）引入現有的細胞支架制備工藝，利用ScCO2對有機溶劑超強的溶解力，將制備過程中殘留的有機溶劑萃取掉[49-50]；二是在超臨界流體技術的基礎上發展形成的ScCO2發泡工藝[51-53]。將ScCO2引入現有的制備工藝，能夠有效地除掉殘留的有機溶劑，但增加了原工藝的復雜性。ScCO2發泡工藝形成的孔徑大小不一，孔隙率較小，易形成閉合孔[48]。研究表明，這與聚合物的玻璃化轉變溫度Tg直接相關[54-55]。滲入了ScCO2的聚合物在迅速降壓過程中，如果其玻璃化轉變溫度Tg升高（例如結晶性聚合物），所形成的空泡就會閉合，無法形成相連通的孔。或者出現并泡現象，形成一些大泡孔，導致部分結構破壞。因此，ScCO2發泡工藝尚不適用于結晶性聚合物。

超臨界反溶劑（Supercritical Anti-Solvent，簡稱SAS）工藝本來是為制備納米/微米超細微粒而開發的一種先進的超臨界流體工藝，但用它來制備多孔結構也十分有效。在制備醋酸纖維素超細微粒研究時發現，當醋酸纖維素溶液（溶劑為丙酮）濃度為8%時，得到的是平均粒徑為2.8μm的醋酸纖維素球形微粒。如果將溶液濃度提高到20%（W/W）時，會形成平均孔徑為25μm的多孔結構。

后續的研究表明，用SAS工藝制備組織工程細胞支架優勢突出[57]。對該工藝過程中的相平衡熱力學和擴散動力學進行深入研究后揭示了多孔結構的形成機理。用SAS工藝制備高分子聚合物多孔結構具如下特點[57]：①由于ScCO2具有超強的溶解能力和滲透性，它不僅可將溶液中的有機溶劑“萃取”出來（促使發生液―液相分離后，將有機溶劑完全溶解），而且可滲透到高分子聚合物相，將殘留在聚合物中的有機溶劑萃取出來，從而得到純度很高的細胞支架。②ScCO2不僅具有“萃取”作用，而且會對所形成的多孔結構起到“干燥”作用。由于超臨界流體的特殊性能（可連續地進入氣相或液相狀態，不發生相變），ScCO2對所形成的多孔結構的“干燥”過程不產生氣—液界面，因而不會產生過大的表面張力，這就徹底解決了現有工藝干燥過程的結構塌陷問題。③因ScCO2價廉、無毒、不燃燒、不污染環境，而且能使SAS過程在接近常溫（其臨界點只有31℃）下進行，這為熱敏性（如生物活性材料）引入細胞支架提供了一條有效途徑。④通過簡單的減壓就可以使有機溶劑和反溶劑分離，且溶劑與反溶劑均可循環使用；工藝流程簡單，可實現“一步法”操作。⑤控制操作條件（壓力、溫度、濃度等），可以控制所形成細胞支架孔的結構與形態，實現對產品結構的預設計與制造控制。

研究已經揭示了SAS工藝形成多孔結構的機理[58]，這可借助于三元相平衡圖（圖1）來說明。圖中雙結點線代表著液—液分層的邊界，在雙結點線以外（靠近聚合物和溶劑頂點側）為均相區，在雙結點線以內，為非均相區。由雙結點線與旋節線將非均相區劃分為三個區，在臨界點（雙結點線與旋節線的交點）以上和以下由雙結點線與旋節線組成的兩個亞穩定區和以旋節線為邊界的非穩定區。圖1表示的是“PMMA/DMSD/ScCO2”三元體系，圖中3條帶箭頭的線代表了三種傳質路徑，1、2、3三條路徑在某一點初始濃度分別為25%（W/W）、10%（W/W）和5%（W/W）。多孔結構形成過程在壓力為20MPa、溫度為35℃下進行。第1條傳質路徑是在臨界點以上跨越雙結點線進入液—液分層的亞穩定區，此時液滴的成核與長大是在PMMA貧含相進行的，因此PMMA固化后成為連續相，而微孔成為分散相，即形成了多孔結構。第3條傳質路徑是在臨界點以下跨越雙結點線進入液—液分層的亞穩定區，此時液滴的成核與長大是在PMMA富含相進行，因此PMMA固化后成為分散相，微孔成為連續相，即形成了分散微粒。第2條傳質路徑是在臨界點附近，同時跨越雙結點線和旋節線進入非穩定液－液分層的亞穩定區，此時液滴的成核與長大同時在PMMA貧含區和富含區進行，因此可得到微孔和微粒共存的過渡結構。

圖1 聚合物/溶劑/超臨界CO2三元體系相圖Fig.1 Polymer/solvent/supercritical CO2ternary system diagram

3 組織工程細胞支架的研究開發新途徑

從研究內容上看，第二代細胞支架的研究重點是探索發展生物活性和生物可吸收細胞支架的各種途徑，從而開發了許多支架材料和制備方法。進入21世紀后，新一代（第三代）細胞支架的開發研究受到關注，研究內容基本上集中在探索將生物活性和生物可吸收兩種材料進行復合的方式和效果。總體上講，屬于可行性研究。所有這些研究結果，還不能對細胞支架進行“設計”。也就是說，目前的研究只限于在某種條件下會產生什么結果，但未涉及某種結果是由什么條件產生這樣的問題。解決了這一問題，就可以對細胞支架進行設計。

要解決細胞支架的設計問題，就要建立細胞支架制備條件與其性能之間的關系。要確定這樣的關系，就要開展細胞支架的綜合性能研究。

就三維多孔骨細胞支架而言，其綜合性能主要包括3方面：結構性能、力學性能和生物性能。結構性能主要包括細胞支架的幾何特性（支架的孔徑及其孔隙率）和復合材料在支架中的結構形態，力學性能主要包括細胞支架的強度和剛性，生物性能主要包括細胞支架的降解性和生物活性。

研究開發新一代復合骨細胞支架的途徑之一是：利用三類材料進行復合，第一類是合成生物可降解高分子材料，第二類是天然生物可降解高分子材料，第三類是生物活性材料。第一類材料如聚乳酸（PLA）和聚己內脂（PCL），第二類材料如淀粉和殼聚糖，第三類材料如生物活性玻璃（45S5）和羥基磷灰石（HA）等。第一類材料是細胞支架的主體材料。復合第二類材料的目的是改善復合支架的親水性，調節復合支架的降解速率和強度、剛性，使其滿足特定需要。例如，支架的降解速率要與新骨的生成速率相匹配，支架的強度和剛度要與原骨的強度和剛度相近。復合第三類材料的目的是使細胞支架具有生物活性。

利用超臨界CO2反溶劑（SAS）工藝制備上述復合細胞支架。SAS工藝除了具備前述的5方面的特點外，還能使復合過程一次完成，更主要的是能夠控制三類復合材料在形成的復合細胞支架中的結構形態。為了使復合細胞支架具備更強的力學性能和生物性能，希望在形成的復合細胞支架中，第一類和第二類材料均勻混合形成細胞支架主體，第三類材料以微粒（納米或微米級）的形態黏附在支架主體內孔的內壁上。研究表明，當生物活性成分以納米或微米微粒的形態分布在支架內孔的內壁面時，相對被包覆在支架主體結構內而言，其可溶性離子的釋放速率、生長因子的吸附、成骨細胞的附著以及基質體的礦化程度等都會大幅提高。這是因為，納米或微米微粒具有更大的表面積，它黏附在支架內孔的內壁面時，更加有利于表面反應的快速進行[13]。

三類材料在用SAS工藝制備的復合材料細胞支架中的結構形態是由體系的相平衡和傳質規律決定的[59]。ScCO2與每一類材料以及所選用的溶劑都存在如圖1所示的三元相平衡圖[60]。盡管每一體系由于其他兩個體系的存在，使其相平衡及傳質行為變得更加復雜，但仍然可以借此三元相平衡圖來定性地說明每一類材料在復合支架中的結構形態。也就是說，要保證第一類和第二類材料在復合支架中以連續相的形態形成支架主體，它們在各自的三元相圖中的傳質路徑是，在臨界點以上跨越雙結點線進入液—液分層的亞穩定區。要保證第三類材料在復合支架中以分散相的形態（微粒）黏附在支架主體內孔內壁，其三元相圖上的傳質路徑是，在臨界點以下跨越雙結點線進入液—液分層的亞穩定區。顯然，只要控制好體系的相平衡和傳質行為，就能控制三類材料在復合支架中的結構形態。也就是說，復合體系的相平衡和傳質規律，是復合支架結構形態的理論基礎。

因此，要開發上述復合細胞支架，需要開展幾方面的研究：①細胞支架制備條件與其結構性能的關系。制備條件主要包括材料成分、工藝參數和溶劑特性。材料成份包括第一類、第二類及第三類材料及所占比例，工藝參數包括體系的壓力和溫度，溶劑特性包括體系溶劑及溶液濃度等；結構性能主要包括支架的幾何特性及三類材料在支架中的結構形態等；支架的幾何特性包括支架的孔徑及孔隙率等。②細胞支架制備條件與其力學性能的關系。力學性能主要包括支架的強度和剛性等。③細胞支架制備條件與其生物性能的關系。生物性能包括支架的降解速率和生物活性等。④制造細胞支架的SAS工藝中多元體系相行為與傳質行為。主要針對“第一類材料/第二類材料/第三類材料/溶劑/ScCO2”等組成的復雜多元體系的相平衡關系和質量傳遞規律進行研究。

通過開展上述4方面研究可達到如下目標：形成一種制備新一代細胞支架的先進工藝—超臨界CO2反溶劑工藝，發展一種結構性能、力學性能和生物性能等綜合性能優良的新一代骨細胞支架。確定支架制備條件與支架結構性能和力學性能，以及支架降解速率之間的定量關系，為支架結構的優化以及根據使用環境需要對支架的力學強度、剛性及降解特性進行設計奠定基礎。確定支架制備條件與支架生物活性間的關系，為支架生物活性最佳設計提供依據。掌握制備支架SAS工藝中復雜體系的相平衡和質量傳遞規律，為三類材料在支架中的結構形態的最優化提供理論依據。

作為組織工程基本要素的細胞支架，在短短的幾十年內取得了重大研究進展。開發新一代細胞支架，使其在結構、力學和生物等方面具有良好的綜合性能，是組織工程細胞支架的發展方向。采用先進的SAS工藝，將成生物可降解高分子材料、天然生物可降解高分子材料和生物活性材料等三類材料進行復合，制備性能可調控、綜合性能優良細胞支架，是細胞支架研究開發的新途徑。SAS工藝涉及的多元復雜體系的相行為和傳質行為，是開發SAS工藝的理論基礎。

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Research Progress of the New Generation of Scaffolds

LIZhiyi，DING Zhaohong，LIU Zhijun.
Dalian University of Technology,Dalian 116024,China.Corresponding author:LIZhiyi(E-mail：lizy@dlut.edu.cn).

Tissue engineering;Scaffold;Supercritical anti-solvent process

Q813.1+2

B

1673－0364（2012）03－0167－05

2012年3月16日；

2012年4月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.013

國家自然科學基金項目（30870646）。

116024遼寧省大連市大連理工大學。

李志義（E-mail：lizy@dlut.edu.cn）。

【Summary】Scaffold is critical in building a tissue-engineered organ or tissue.After a short period of fruitful development, the scaffold has been on its way from the first and second generations to the third generation.In this paper,the main characteristics of the third generation scaffold are discussed.The latest developments of the preparative technologies of scaffolds are introduced with the emphasis on the supercritical anti-solvent(SAS)process and its distinguishing features, outstanding advantages and key techniques.It is pointed out that an important way of developing the third generation scaffoldswith excellentand adjustable structural,mechanical and biological characteristics is to prepare the scaffolds by SAS process with the composite materials of three categories:synthetic biodegradable polymers,natural biodegradable polymers and bioactivematerials.By thisway,what is studied and which is achieved are also proposed.