粘液與非粘液型鮑曼不動桿菌誘導肺腺癌細胞產生IL-8的研究

李宏 李偉 王星冀 張金艷 郭秀娟 李麗 魏媛媛

研究表明，從細菌黏附定居、生長擴散到宿主的生理失衡，均與不同種類的細胞因子有關［1］。本文對兩種菌落形態的鮑曼不動桿菌的活菌菌懸液、培養上清液及菌體裂解液誘導人肺腺癌細胞表達白介素-8(IL-8)的能力進行研究。目的在于初步探討鮑曼不動桿菌引起肺癌細胞感染的機制，該菌是否能直接誘導人肺腺癌細胞表達IL-8從而引發炎性反應，以及兩種表型的鮑曼不動桿菌刺激細胞表達IL-8的能力是否有差別。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞來源 鮑曼不動桿菌本室分離保存，A549細胞購自協和醫科大學基礎醫學院細胞中心。

1.2 主要試劑 PRMI-1640，Gibco公司。胎牛血清，杭州四季青生物制品研究所。哥倫比亞瓊脂，法國生物梅里埃公司。Trizol，Invitrogen公司。RT試劑盒，Fermenters公司。PCR試劑盒，Promege公司。瓊脂糖，REGULAR公司。DNA marker，Fermenters公司。

1.3 儀器 低溫離心機20B型，日本HITACHISCR。7300 PCR擴增儀，美國ABI。DF-CⅡ型水平電泳槽，北京東方。凝膠成像儀，美國FOTODYNE公司。

1.4 主要方法

1.4.1 活菌懸液制備:收集平板上過夜的細菌，將其懸于無雙抗無血清的RPMI-1640中并混勻，制備2×109cfu/ml的菌懸液，并依次稀釋10倍、100倍，使其終濃度為2×108cfu/ml、2×107cfu/ml。

1.4.2 菌體裂解液制備:分別將3個濃度的活菌懸液20 ml在冰浴下超聲(頻率為5 000 Hz)30 min，過濾除菌。

1.4.3 耗盡上清液的制備:250 ml的LB培養基中加入2×109cfu/ml的菌懸液2 ml，150 r/min震蕩培養72 h，離心取上清并過濾除菌。

1.4.4 細胞培養:肺腺癌細胞 A549，37℃，5%CO2培養箱孵育，培養基為含10%胎牛血清，100 μg/L的鏈霉素和100 U/ml的青霉素，RPMI-1640。待其在25 cm2的培養瓶中長至單層(約2×106)，棄去培養基，用D-hank’液沖洗三遍，向其中加入2 ×109cfu/ml、2 ×108cfu/ml、2 ×107cfu/ml的菌懸液、菌體裂解液及培養上清液3 ml，與細胞共同孵育6、12、24 h。

1.4.5 人肺腺癌細胞總RNA的提取:細胞用D-hank’沖洗三遍。加入Trizol 1 ml，充分吹打后，將其移到無RNA酶的EP管中，于冰上靜置10 min。加入氯仿0.2 ml，加蓋，用力震蕩12 s后，冰上靜置5 min。4℃，10 800 r/min離心15 min。吸取上層水相，轉移至另一無RNA酶的EP管中。在EP管中加入等量的異丙醇，加蓋，上下顛倒混勻，冰上靜置10 min，形成RNA沉淀。同上離心10 min，棄上清。加入0.4 ml 75%乙醇充分洗滌沉淀，4℃，8 550 r/min離心5 min，棄上清，將 RNA沉淀溶于40 μl無RNA酶的蒸餾水中。采用紫外分光光度計測定RNA濃度，使 A260/A280 比值在1.8 ～2.0，并稀釋至1 μg/μl，于4 h內進行cDNA的合成。

1.4.6 cDNA的合成(逆轉錄):0.5 ml無 RNA 酶的微量離心管內加入總 RNA 6 μl，oligo(dT)1 μl，DEPC 水 5 μl，于 70℃ 預熱5 min，迅速置冰上，離心數秒。加入5 × buffer 4 μl、dNTP Mix(10 mmol/L)2 μl、RNAnasin(20 U/μl)1 μl。37℃預熱5 min，迅速置冰上。再向微量離心管內加入MMLV 1 μl。42℃恒溫60 min，進行逆轉錄反應，70℃加熱10 min，滅活逆轉錄酶活性。

1.4.7 引物的合成:IL-8引物序列參考文獻［1］，上海生工生物工程公司合成。引物序列如下:

IL-8 5’-CGATGTCAGTGCATAAAGACA-3’ 200

5’-TGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAA-3＇β-actin 5’-AAATCGTGcGTGACATTAA-3＇ 472

5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3

1.4.8 PCR 擴增:0.5 ml微量離心管內加入 2 ×GoTaq Green Master Mix 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)2.5 μl、下游引物(10 μmol/L)2.5 μl、DNA 模板 2 μl、雙蒸水 5.5 μl。反應條件為:94℃ 10 min，94℃ 1 min，53℃ 45s，72℃ 80 s，30 cycles，72℃10 min。內參(β-actin)95℃ 5 min，94℃ 1 min，58℃ 45 s，72℃60 s，40 cycles，72℃ 10 min。

1.4.9 PCR產物定量分析:將擴增產物4 μl上樣于1%瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液，電壓80 V/cm。分析電泳結果，以待測細胞因子的光密度對同一標本內參(β-actin)光密度的比值表示該細胞因子mRNA的表達水平。

1.5 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種鮑曼不動桿菌活菌菌懸液及培養上清液與肺腺癌細胞IL-8表達比較 孵育后均只在24 h時間點表達IL-8;粘液型的菌體裂解液在2×108cfu/ml時可以誘導人肺腺癌細胞表達IL-8，而在2×109cfu/ml、2×107cfu/ml時均不能誘導人肺腺癌細胞表達IL-8;非粘液型的菌體裂解液在各濃度則均不能誘導人肺腺癌細胞表達IL-8。見表1。

2.2 粘液型與非粘液型的活菌懸液誘導肺腺癌細胞表達 粘液型在2×108cfu/ml時最強，且差異有統計學意義(P＜0.01);非粘液型的活菌菌懸液誘導肺腺癌細胞表達IL-8的能力隨著濃度的降低而增強，且差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

2.3 粘液型和非粘液型的菌液比較 2×108cfu/ml粘液型的活菌菌懸液較非粘液型的誘導表達IL-8能力強，培養上清液均較非粘液型的誘導表達 IL-8能力弱，且差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

2.4 菌懸液與裂液比較 2×108cfu/ml的粘液表型的活菌菌懸液較菌體裂解液表達 IL-8能力強，且具差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1粘液與非粘液鮑曼不動桿菌IL-8的表達情況±s

表1粘液與非粘液鮑曼不動桿菌IL-8的表達情況±s

注:與2 ×109菌懸液比較，*P ＜0.01;與2 ×108菌懸液比較，#P ＜0.01;與2×108菌懸液比較，△P ＜0.01

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3 討論

細胞因子通常是一組可溶性多肽、蛋白質或糖蛋白，對細胞、組織和機體功能起調控作用。目前，主要將它劃分為六類，分別是白介素、細胞毒細胞因子、干擾素、集落刺激因子、生長因子、趨化因子。IL-8作為一種趨化因子，是一種強效的中性粒細胞趨化物質，可將白細胞吸引到損傷、炎癥和感染部位。IL-8具有顯著的PMN趨化作用特異性，可在肺部積聚;IL-8釋放的增加是導致肺部感染中性粒細胞(PMNS)聚集最主要的原因［2，3］。

2種菌落的鮑曼不動桿菌活菌菌懸液及培養上清液與肺腺癌細胞孵育后均只在24 h時間點表達IL-8;粘液型的菌體裂解液在2×108cfu/ml時可以誘導人肺腺癌細胞表達IL-8，而在2×109cfu/ml、2×107cfu/ml時均不能誘導人肺腺癌細胞表達IL-8;非粘液表型的菌體裂解液在各濃度則均不能誘導人肺腺癌細胞表達IL-8。說明兩種菌落的鮑曼不動桿菌活菌、分泌因子均可以吸引中性粒細胞的集聚誘發或加重感染;粘液型鮑曼不動桿菌的菌體成分僅在2×108cfu/ml這個合適的濃度時才有可能參與該過程，非粘液型的鮑曼不動桿菌的菌體成分則可能不參與該過程。

本研究粘液型菌懸液在高濃度2×109cfu/ml時刺激肺腺癌細胞表達細胞因子IL-8，與非粘液型差異無統計學意義(P＞0.05)，說明菌懸液濃度高時，不同型的菌株均可吸引大量中性粒細胞集聚造成損傷。

3個濃度為的兩種菌落形態的鮑曼不動桿菌活菌菌懸液均能誘導人肺腺癌細IL-8的表達，IL-8隨著菌懸液、菌體裂解液濃度的降低呈增強趨勢。說明鮑曼不動桿菌雖然可以誘導人肺腺癌細胞表達，但濃度過高的菌懸液中細菌(或菌體成分)較多，導致細胞最大程度的破碎，那么細胞表達的IL-8量也就較少。

粘液表型鮑曼不動桿菌的菌體裂解液在2×108cfu/ml可誘導人肺腺癌細胞 IL-8的表達，在 2×108cfu/ml、2×107cfu/ml濃度時不能誘導人肺腺癌細胞IL-8的表達?？梢奍L-8的表達并非與菌體裂解液的濃度成正相關，而是存在一個最適濃度。

粘液表型的耗盡上清液(SCS)較非粘液表型的SCS誘導人肺腺癌細胞表達IL-8強，說明粘液表型的鮑曼不動桿菌在代謝過程中可以產生較非粘液表型的鮑曼不動桿菌更多的有生物活性的可溶性產物，其分泌因子的性質和數量尚待進一步探討。

3個濃度鮑曼不動桿菌菌懸液較同濃度菌體裂解液誘導人肺腺癌細胞表達IL-8的能力強，說明鮑曼不動桿菌誘導人肺腺癌細胞表達IL-8主要不是通過細菌或菌體成分與細胞膜受體分子的相互作用，而更加依賴于活菌對上皮細胞的侵襲，進入到細胞內，激活胞內受體而起刺激作用。

1 Beck GC，Rafat N，Brinkkoetter P，et al.Hetero Geneity in lipoplysaccharide responsiveness of endothelial cells identified by Gene expression profiling:role of transcription factors.Clinical and Experimental Immunology，2006，143:523-533.

2 Luppi F，Longo AM，de Boer WI，et al.Interleukin-8 stimulates cell prolifertion in non-samll cell lung cancer through epidermal growth facter receptor transactivation.Lung Cancer，2007，56:25-33.

3 Araki S，Omori Y，Lyn D，et al.Interleukin-8 is a molecular determinant of androgen independence and progress in prostate cancer.Cancer Res，2007，67:6854-6862.