Smad6信號干擾對MSCs骨向分化中Smad5及Smurf1基因表達的影響

劉猛 董偉 馮曉潔 鄧久鵬 戚孟春 李金源

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是目前刺激骨組織形成最強的生長因子，其生理效應是通過靶細胞表面Ⅰ型、Ⅱ型受體及胞內Smads信號通路來發揮的［1］。在Smads信號通路中，Smad6對BMPs信號傳遞起抑制作用，形成了BMPs信號傳遞的自身負反饋調控機制［2－4］;其單獨或與其它協同抑制子(如Smad泛素化調節因子-1，smad ubiguitin regulatory factor-1，Smurf1)一起，可以影響其他 Smads分子(如Smad5)的信號傳遞［5，6］。本研究在前期構建的小鼠 Smad6慢病毒干擾載體的基礎上，探索Smad6信號干擾對小鼠間充質干細胞(MSCs)骨向分化中Smad5及Smurf1基因表達的影響，從而進一步揭示應用Smad6信號干擾促進BMP-2誘導的MSCs骨向分化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的重組干擾載體 pGCSIL-GFP-Smad6，為自行構建［7］。D/F12 小鼠骨髓MSCs專用培養基，購自廣州賽業;胎牛血清購自hyclone公司;Percoll分離液購自美國PHAMACIA公司;人重組BMP-2購自北京博奧森生物技術有限公司。TrizolTMRNA Isolation Reagent，美國Gibco BRL 公司;iQ SYBR Green supermix，美國 Bio-Rad公司;上下游引物，上海生工合成。兔抗鼠單克隆抗體(一抗)，購自美國SANTA CRUZ公司。

1.2 重組干擾載體對間充質干細胞(MSCs)的轉染及骨向分化 密度梯度離心法培養小鼠骨髓MSCs［8］，應用含15%胎牛血清的DMEM/F12培養基進行培養。取第三代MSCs用于本實驗。實驗分為A、B、C 3組:A組，細胞作為對照組;B組，空白載體轉染+BMP-2誘導;C組，重組干擾載體轉染+BMP-2誘導。轉染病毒液均為50 μl/孔。轉染前更換培養基，換用無血清的培養基，使細胞同步化。應用病毒載體轉染B、C 2組MSCs，轉染第72小時后，更換新鮮培養基，熒光顯微鏡下觀察;并用200 ng/ml的rhBMP-2對小鼠骨髓MSCs進行骨向誘導。于BMP-2誘導第6、24小時兩個時間點收獲細胞，進行相關檢測。

1.3 SyberGreen實時熒光定量PCR檢測Smurf1的基因表達水平 參照NCBI Genebank中小鼠Smurf1和GAPDH基因序列，根據SyberGreen Real-time PCR的要求，設計待檢測基因上下游引物。見表1。

表1 小鼠基因Smurf1和GAPDH的Real-time RT-PCR引物

Trizol提取總RNA，用RT-PCR kit在Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀上逆轉錄成cDNA后，取逆轉錄產物進行實時熒光定量RT-PCR;引物標記采用熒光染料SYBR Green。PCR擴增反應條件為:94℃ 2 min;53℃ 20 s，60℃40 s，共 45個循環。GAPDH的cDNA經倍比稀釋后進行同期PCR，用于回歸分析。反應結束后在PCR儀上自動讀取閾值Ct;PCR產物同時進行瓊脂糖凝膠電泳分析。每組細胞檢測三個樣本(n=3)。

1.4 Western-blot檢測磷酸化 Smad5(pSmad5)、Smad5 和Smurf1蛋白水平 MSCs經病毒轉染及BMP-2骨向誘導后，于兩個時間點收獲B、C兩組細胞，提取總蛋白。測定蛋白濃度，以每孔90 pg上樣，濃縮膠電泳條件為80 V、30 min;分離膠條件為150 V、2 h;恒流電轉膜2.5 h。5% 牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗4℃過夜，二抗室溫60 min，BCIP/NBT顯色1 min。硝酸纖維素膜上蛋白表達的條帶用自動圖像分析系統(Image J)進行分析。

1.5 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，3組細胞基因相對濃度進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒載體轉染小鼠骨髓 MSCs后GFP觀察 B、C 2組MSCs分別經空白載體和重組病毒載體轉染，24 h后綠色熒光蛋白(GFP)開始表達，在熒光顯微鏡下細胞胞漿呈綠色;轉染后72 h，GFP表現為強表達(圖1)，病毒對細胞的轉染效率接近100%;在BMP-2處理后，兩組細胞內GFP仍持續強表達，提示病毒載體的轉染為穩定轉染。

圖1 病毒轉染MSCs 72 h后GFP表達(熒光顯微鏡×100)A:B組(空白病毒載體);B:C組(重組病毒載體)

2.2 實時定量PCR檢測Smurf 1基因表達 將待測樣品在定量PCR儀上進行擴增反應，采集每一反應管中熒光強度的變化，并繪制動力學曲線，得出樣品熒光強度增加到閾值時的Ct值，并由分析軟件自動計算出與內參管家基因GAPDH比較的ΔCt值，以及與A組(無病毒轉染及BMP-2處理)ΔCt值比較的ΔΔCt。樣本相對濃度 =1/2ΔΔCt。

在兩個時間點，3組Smurf 1相對濃度經單因素方差分析均有統計學意義(P＜0.01);除BMP-2誘導6 h時A、B 2組間差異無統計學意義外，兩個時間點各組兩兩比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。提示 BMP-2誘導顯著提高了 MSCs中Smurf1基因的表達，而Smad6 RNA干擾使其表達進一步顯著上升;隨著時間的延長，這種變化更明顯。見表2，圖2。

表2 SyberGreen實時定量PCR檢測Smurf 1基因表達n=3，±s

表2 SyberGreen實時定量PCR檢測Smurf 1基因表達n=3，±s

注:與 A 組比較，*P ＜0.01;與 B 組比較，#P ＜0.01

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圖2 實時定量PCR檢測Smurf 1基因相對濃度

2.3 Western-blot檢測pSmad5、Smad5和Smurf1蛋白水平 在BMP-2處理后兩個時間點，B組(空白載體)、C組(重組載體)細胞Smad5總蛋白水平變化不顯著，未受Smad6信號干擾的影響。而pSmad5的蛋白水平在C組比B組則明顯提高，蛋白條帶灰度值在兩個時間點分別上升了26.31%和48.21%。上述結果說明，Smad6信號干擾雖然對Smad5總蛋白水平沒有影響，但明顯提高了磷酸化Smad5的水平，即促進了Smad5磷酸化，從而增強BMPs的信號傳導。Smurf1蛋白水平的變化規律與pSmad5相似。C組Smurf1蛋白水平在兩個時間點比B組均明顯提高，蛋白條帶灰度值分別上升了63.72%和58.65%。提示Smad6干擾后，Smurf1蛋白代償性表達增高，在一定程度上補償了因Smad6干擾對BMPs信號負調控的抑制。見圖3。

圖3 Western blot檢測pSmad5、Smad5、Smurf1的蛋白水平

3 討論

Smad6是BMPs信號通路中重要的自身負反饋調控因子［2－4，9］。在 BMPs刺激下，胞內 Smad1、Smad5 等受體型 Smad(R-Smad)與Smad4結合成異源多聚體，易位進入核內，作用到靶基因特異序列，發揮BMPs各種生理效應。Smad6基因上有SBE序列(smad binding element)，能夠與R-Smad直接結合;并激活了 Smad6基因轉錄，使其表達水平迅速升高［3，9］，發揮對BMPs信號的負調節作用。

研究表明，Smad6可在胞漿內直接與BMPs I型受體結合，阻礙R-Smad(Smad1、Smad5)磷酸化(激活);也可與 Smad1、Smad5直接結合，阻礙它們與Smad4形成異源多聚體，進而發揮阻礙 BMPs 信號傳遞的作用［2，3，9］。

同時，Smad6的表達和活性受許多其它信號分子的協同調節;在這些協同分子中，大多數是Smad6的協同抑制子(corepressor);Smurf1便是其中之一。Smurf1高表達在體外可抑制成骨細胞前體細胞2T3骨向分化;在體內會使成骨細胞增殖和分化顯著下降，并導致骨小梁體積及骨形成速度顯著降低［10］。而Smurf1突變失活則可增強BMP-2誘導的成骨細胞前體C2C12和2T3細胞的骨向分化［11］。Smurf1可直接與BMPs I型受體及Smad1、Smad5結合，使蛋白泛素化(uniquitiation)，從而導致蛋白降解，阻礙BMPs信號傳導。Smurf1還可與Smad6形成復合體，使其與I型受體及Smad1、Smad5的結合更為容易;這樣，一方面發揮Smad6阻礙BMPs信號傳導的作用，另一方面發揮Smurf1對蛋白的降解作用，使對BMPs信號的負調控更強［5，6，10－12］。在共同調控中，Smurf1 與 Smad6 復合體對磷酸化的Smads的作用比非磷酸化的Smads作用更強。

在前期研究中，我們已證實Smad6信號干擾可有效促進BMP-2誘導的MSCs骨向分化中(另文報道);然而，Smad6信號干擾會對Smads信號通路中其它信號分子(如Smad5、Smurf1)產生怎樣的影響，正是本研究所要解決的問題。

本研究結果表明，在BMP-2誘導的MSCs骨向分化中，Smad6信號干擾可有效促進Smad5蛋白磷酸化，而對Smad5總蛋白量無影響。提示Smad6信號干擾有效解除了其對Smad5磷酸化的抑制，從而促進了信號傳遞，增強了BMPs的效應，表現為MSCs骨向分化增加。同時，本研究表明，Smad6信號干擾一定程度上增加了Smurf1的mRNA及蛋白表達。由于Smurf1是Smad6的協同抑制子，發揮著對BMPs信號傳遞的抑制作用，因而上述結果提示機體內部存在一定的代償機制，在Smad6被干擾后，Smurf1蛋白代償性表達增高，在一定程度上補償了Smad6分子對BMPs信號的負調控。

鑒于BMPs體內信號轉導的復雜性，Smad6引號干擾不僅能促進BMP-2誘導的骨向分化，影響Smad5磷酸化及Smurf1基因表達，還可能對下游一系列信號分子及效應基因產生影響，從而發揮BMPs促進骨再生的效應。然而有哪些信號分子及效應基因會受到影響?它們的基因表達會發生怎樣的變化?尚待進一步深入研究。

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