益生菌制劑對早期斷奶仔豬腸道p H、黏膜形態結構和揮發性脂肪酸含量的影響

劉虎傳 張敏紅 李素霞 馮京海 姜海龍 楊家軍 殷瑞娟

腸道是重要的營養吸收器官，腸道上皮還是阻止外界環境有害物質入侵機體的重要屏障。腸道屏障是由腸上皮、上皮間緊密連接及基底膜等構成。應激損傷腸道屏障功能，導致腸道內毒素入侵體內。腸道完整性的損傷會引起腸道通透性的增加，導致從生理到病理炎癥的轉變，這也是腸道疾病的一個重要特征［1］。斷奶應激對仔豬腸道功能的影響一直備受關注。嚴汝南［2］報道3～4周齡仔豬斷奶會破壞腸道的正常微生物區系和絨毛結構。斷奶會引起仔豬的血液生化和免疫指標發生顯著變化，如乳酸脫氫酶活力顯著上升，免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A、總蛋白、白蛋白、球蛋白水平迅速下降［3］。某些血清激素水平及細胞免疫功能也受到影響，如血清皮質醇水平顯著升高，血清甲狀腺素、游離甲狀腺素、生長激素、胰島素水平顯著降低，淋巴細胞轉化率和白細胞吞噬率顯著降低［4］。因此，改善應激條件下仔豬腸道的屏障功能可能為緩解斷奶應激提供一種有效途徑。

益生菌是指攝入一定量后能對宿主產生益生作用的活的微生物［5］。益生菌能改善腸道屏障功能，調節腸道免疫系統。Scharek等［6］在仔豬飼糧中添加屎腸球菌能提高早期腸道微生物的定植，降低病原菌的數量。Lodemann等［7］通過豬的益生菌作用模型研究，發現屎腸球菌NCI MB 10415可降低病原菌在健康仔豬腸道中的數量。Takahashi等［8］發現在飼糧中添加植物乳桿菌能增加腸道中乳酸桿菌的數量。Siggers等［9］給新生仔豬飼喂乳酸桿菌和雙歧桿菌的復合菌，促進了有益微生物的定植，能夠降低人工誘導的黏膜萎縮、腸功能性障礙。Collado等［10］發現雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌能顯著降低沙門氏菌、大腸桿菌和厭氧芽孢梭菌在豬腸道黏膜上的黏附。大量研究表明，益生菌具有緩解斷奶應激的潛力，但其作用機制并不十分清楚。益生菌的益生功效與它的屬、種和菌株本身有關。Sanders等［11］研究了不同益生菌屬、種和菌株對宿主的益生作用，發現復合的菌株或菌種比單一菌株更有效。目前，混合不同屬或種的益生菌制劑是一個研究熱點。關于益生菌制劑對早期斷奶仔豬小腸各部位黏膜形態的影響報道很少。本試驗通過測定仔豬腸道p H、黏膜形態結構和揮發性脂肪酸含量，探討由屎腸球菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌組成的益生菌制劑對緩解早期仔豬斷奶應激的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

益生菌制劑包含1.6×1011CFU／g屎腸球菌，1.1×1011CFU／g植物乳桿菌和1.3×1011CFU／g枯草芽孢桿菌，所用菌粉購自亞芯（南京）生物科技有限公司。

1.2 動物與分組

試驗選取（21±2）日齡的初始平均體重為（6.39±0.42）kg“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬48頭，按性別、體重和窩源基本一致原則，隨機分為2個組，每個組4個重復，每個重復6頭豬。

1.3 基礎飼糧及飼養管理

參照NRC（1998）5～10 kg仔豬飼養標準配制玉米－豆粕型基礎飼糧，基礎飼糧組成及營養水平見表1。試驗1組為對照組，采用基礎飼糧；試驗2組為益生菌組，每千克基礎飼糧中添加1×109CFU活菌。試驗在河北邢臺金鳳種豬場進行。全封閉豬舍，紅外燈保溫。粉料飼喂，乳頭式飲水器，自由采食和飲水。按照豬場常規管理程序進行免疫驅蟲。試驗期為21 d。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（飼喂基礎）Table 1 Co mposition and nutrient levels of the basal diet（as－fed basis） %

1.4 樣品的采集與處理

21、28、35和42日齡時，從每個組的每個重復中隨機選取1頭豬屠宰，剪取空腸前1／4段、空腸后1／4段、回腸中段腸管（3 c m），立即測定腸道內容物p H，然后用生理鹽水沖洗凈內容物，將腸道組織置于10%甲醛磷酸緩沖液中固定，用于測定腸黏膜形態結構；選擇盲腸結扎，取出帶有食糜的腸段，測定內容物p H，然后液氮中保存，用于內容物揮發性脂肪酸含量的測定。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 p H測定

用雷磁SJ－4 A型p H計測定空腸前1／4段、空腸后1／4段、回腸中段和盲腸內容物的p H。

1.5.2 腸道黏膜形態結構測定

固定后的腸道組織樣品經脫水以石蠟包埋，連續切片（5μm），以蘇木精－伊紅（HE）對切片進行染色。用顯微鏡觀察腸道黏膜結構，并以Motic Med 6.0圖像軟件分析。每張切片測定10根完整絨毛的絨毛高度和隱窩深度，選擇5張切片計算每個組織的平均值。

1.5.3 腸道上皮內淋巴細胞數量測定

HE染色后的5張切片，每張選擇5個視野對上皮細胞和上皮內淋巴細胞計數。上皮內淋巴細胞計數表示為每100個上皮細胞對應的上皮內淋巴細胞數量。

1.5.4 腸道杯狀細胞數量測定

以高碘酸－希夫（PAS）對杯狀細胞進行染色。選擇5張切片，每張切片選擇5個視野對杯狀細胞進行計數。杯狀細胞計數表示為每100個上皮細胞對應的杯狀細胞數量。

1.5.5 盲腸內容物中揮發性脂肪酸含量測定

盲腸內容物中乙酸、丙酸和丁酸含量采用Agilent 6890氣相色譜儀測定，乳酸含量采用戴安CS－3000離子色譜儀測定。結果表示為內容物每克濕重所含揮發性脂肪酸的重量（mg／g）。

1.6 統計分析

用SAS 9.1.3統計軟件對各項數據進行t檢驗。結果以平均值±標準差表示，顯著性水平表示為P＜0.05。

2 結 果

2.1 益生菌制劑對空腸、回腸和盲腸內容物p H的影響

由表2可知，28日齡時，益生菌組回腸內容物p H顯著低于對照組（P＜0.05）；其他日齡益生菌組各腸道組織內容物p H有低于對照組的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 益生菌制劑對空腸、回腸黏膜形態結構和上皮內淋巴細胞及杯狀細胞數量的影響

由表3可知，28日齡時，益生菌組空腸絨毛高度和上皮內淋巴細胞數量顯著高于對照組（P＜0.05）；35日齡時，益生菌組空腸絨毛高度和上皮內淋巴細胞數量顯著高于對照組（P＜0.05），隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05）；42日齡時，益生菌組空腸絨毛高度、上皮內淋巴細胞和杯狀細胞數量顯著高于對照組（P＜0.05），隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05）。

表3 益生菌制劑對空腸黏膜形態結構和上皮內淋巴細胞及杯狀細胞數量的影響Table 3 Effects of pr obiotic preparation on jejunal mucosal morphology and the nu mber of IELs and goblet cells

由表4可知，28日齡時，益生菌組回腸絨毛高度、上皮內淋巴細胞和杯狀細胞數量顯著高于對照組（P＜0.05），隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05）；35日齡時，益生菌組回腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05），隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05）；42日齡時，益生菌組回腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05）。

表4 益生菌制劑對回腸黏膜形態結構和上皮內淋巴細胞及杯狀細胞數量的影響Table 4 Effects of pr obiotic preparation on ileal mucosal morphology and the nu mber of IELs and goblet cells

2.3 益生菌制劑對盲腸內容物中揮發性脂肪酸含量的影響

由表5可知，28日齡時，益生菌組盲腸內容物中丁酸和乳酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）；35日齡和42日齡時，益生菌組盲腸內容物中乙酸、丙酸、丁酸和乳酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 益生菌制劑對斷奶仔豬盲腸內容物中揮發性脂肪酸含量及p H的影響

豬等單胃動物的微生物發酵主要發生在盲腸、結腸及直腸部位，其中盲腸揮發性脂肪酸含量最高［12］。仔豬腸道微生物發酵碳水化合物可以產生多種揮發性脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸，另外還可產生大量的乳酸［13］。這些小分子酸對仔豬腸道的健康起重要作用。H?gberg等［14］研究發現，當飼糧中益生菌含量升高時，仔豬腸道中揮發性脂肪酸的含量顯著增加，同時p H顯著降低。揮發性脂肪酸含量的升高，可以發揮抑菌效應，增加腸道營養物質的吸收。Giang等［15］在仔豬飼糧中添加益生菌制劑，14日齡和35日齡時，回腸和結腸中乳酸和乙酸的含量顯著增加，35日齡時，回腸中丙酸含量也顯著增加。辛娜等［16］研究發現芽孢桿菌能顯著降低空腸和盲腸的p H。蘇勇等［13］發現芽孢乳桿菌能顯著提高35日齡仔豬結腸乙酸、丙酸和丁酸的含量。本試驗中，仔豬添加益生菌制劑也得到類似的結果，盲腸內容物中乙酸、丙酸、丁酸和乳酸含量上升，而p H有所降低。

表5 益生菌制劑對盲腸內容物中揮發性脂肪酸含量的影響Table 5 Effects of pr obiotic preparation on volatile f atty acid content in cecal digesta mg／g

3.2 益生菌制劑對斷奶仔豬空腸、回腸黏膜形態結構和上皮內淋巴細胞及杯狀細胞數量的影響

腸絨毛是小腸上皮和固有層共同向腸腔突出形成的細小突起，可使腸腔的面積擴大約10倍，極大地增加了營養物質的吸收面積。一般情況下，隱窩基部的細胞不斷地分化并向絨毛的端部遷移，形成具有吸收能力的腸上皮細胞以補充絨毛正常脫落的腸上皮。仔豬斷奶后，腸道黏膜萎縮，腸道黏膜上皮絨毛變短，隱窩變深，腸絨毛成熟細胞數量減少［17］。絨毛變短，隱窩變深會減少營養物質的吸收，降低動物的生產性能。顧憲紅等［18］比較了不同斷奶日齡對仔豬腸黏膜形態的影響，發現斷奶日齡越早，仔豬腸黏膜變化越大，其中絨毛高度下降幅度越大，恢復時間越長，一般在斷奶后8～12 d降至最低，隨后恢復較快。本試驗研究發現，益生菌組絨毛高度顯著高于對照組，隱窩深度也低于對照組，說明益生菌制劑為腸道細胞提供了較好的保護作用。

上皮內淋巴細胞分布于腸道上皮細胞之間，與基底膜臨近，由多類群的T細胞組成，是機體與食物和細菌抗原最早、最頻繁接觸的淋巴細胞，因而形成了腸道免疫系統的第一道防線。已有研究表明，應激可誘導小鼠腸道上皮內淋巴細胞的凋亡［19］，而益生菌能增加腸道中上皮內淋巴細胞數量，并 減 少 其 凋 亡［20］。 顧 憲 紅 等［21］研 究 發 現 ，28日齡斷奶仔豬小腸各段上皮內淋巴細胞數量顯著高于17日齡、21日齡和35日齡斷奶仔豬，而21日齡斷奶仔豬小腸各段上皮內淋巴細胞數量顯著低于其他3個日齡組。本試驗添加益生菌制劑后，斷奶仔豬空腸、回腸上皮內淋巴細胞數量得到了一定的增加。

杯狀細胞覆蓋于腸道上皮細胞表面，分泌黏液物質，其主要是黏蛋白。黏蛋白是一種糖蛋白，在管腔內成為潤滑性黏液涂布于腸上皮表面，與柱狀細胞分泌的復合糖蛋白一起構成腸道黏膜上皮細胞表面的細胞衣，而細胞衣的糖蛋白和細胞膜的蛋白質和脂質牢固結合，可捕獲微生物，阻擋病原微生物和有害物質的破壞，是潛在致病源的重要物理屏障［22］。隨腸段后移，杯狀細胞也逐漸增多。應激時，腸道杯狀細胞能快速分泌黏液素以增強腸道的屏障功能，但長期的慢性應激會導致杯狀細胞的枯竭，從而對后續應激和新應激的反應能力減弱。斷奶越早、日齡越小的仔豬腸上皮間杯狀細胞數量越多［22］。陳旭東［23］研究發現，芽孢桿菌能顯著增加斷奶仔豬回腸和盲腸杯狀細胞的比例。丁酸鈉［22］和復方中藥制劑［24］等也均能增加仔豬小腸黏膜杯狀細胞數量。本試驗也得到類似的結果，添加益生菌制劑顯著增加了28日齡回腸和42日齡空腸的杯狀細胞數量，表明益生菌制劑有穩定杯狀細胞分泌，提高仔豬免疫力，緩解斷奶應激的作用。

4 結 論

① 添加益生菌制劑能緩解早期斷奶應激對絨毛高度和隱窩深度的影響，提高腸道內淋巴細胞數量。

② 添加益生菌制劑能增加盲腸內容物中揮發性脂肪酸含量，降低腸道p H。

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