Bcl-2家族研究進展

賈煒

細胞凋亡（apoptosis）是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡［1］。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，由死亡信號誘發的受調節的細胞死亡過程,是細胞生理性死亡的普遍形式。凋亡過程中DNA發生片段化，細胞皺縮分解成凋亡小體，被鄰近細胞或巨噬細胞吞噬，不發生炎癥。凋亡是多基因嚴格控制的過程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等［2］。

近年來,在細胞凋亡調控中起重要作用的B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia-2,Bcl-2)家族蛋白的研究眾多,Bcl-2被證實是最重要的有明顯抑制細胞凋亡作用的基因。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1,Bfel，Al，Ced-9等)和促凋亡蛋白(如Bcl-rambo,Bid，Bax，Bak，Bcl-xS，Bad，Bik等)。多數成員間有兩個結構同源區域，在介導成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實現或功能調節的重要形式。除Bak之外，大部分Bcl-2家族蛋白通過羧基末端的疏水基插入到線粒體外膜上［3］。

目前的研究絕大多數著重揭示的是Bcl-2家族在線粒體與細胞質中如何發揮功能［4］。對Bcl-2家族成員的研究發現，Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中由其抗凋亡成員和促凋亡成員之間協同作用，通過線粒體途徑共同決定細胞是否進入凋亡程序。

1 抗凋亡蛋白

1.1 Bcl-2

Bcl-2的亞細胞定位已經明確，它在不同的細胞類型可以定位于線粒體、內質網以及核膜上，并通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發揮抗凋亡作用。此外，Bcl-2具有保護細胞的功能，Bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱苷肽（GSH）的積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。有報道，Bcl-2經蛋白酶催化裂解后則轉變為促凋亡蛋白質分子,因而可刺激Cyt c釋放［5］。

1.2 Bcl-xL

Bcl-xL是Bcl-2蛋白家族中重要的抗凋亡蛋白［6］，Bcl-xL基因敲除的小鼠表現出比Bcl-2敲除小鼠(幾個月內死于腎衰竭)更嚴重的表型，胚胎13天即死亡。Bcl-xL為一凋亡相關基因，具有兩種RNA拼接形式—長型Bcl-xL及短型bcl-xS，其中BclxLmRNA編碼的蛋白功能類似Bcl-2，可使細胞耐受細胞生長因子撤除誘導的凋亡［7］。Bcl-xL可能作為一種新的耐藥途徑，通過抑制化療藥物誘發的白血病細胞凋亡參與多藥耐藥的形成，可以作為預測耐藥及判定預后的一種參考指標。Bcl-xL在某些腫瘤細胞中的高表達與細胞耐藥相關［8-10］。

1.3 Bcl-w

一些Bcl-w缺失的大鼠也沒有生育能力［11］。

1.4 Mcl-1

Mcl-1是現場所有血細胞（包括免疫系統細胞）的干細胞存活必須的。Mcl-1是個抗凋亡因子，它阻止引導凋亡的Bax和Bak的激活。Mcl-1在保持早期造血干細胞的動態平衡中有特異的，關鍵的作用［12］。

Mcl-1在去IL-6饑餓所引發的XG-7細胞凋亡過程中具有重要作用［13］。Mcl-1基因沉默增強了二烯丙基二硫(DADS)誘導的細胞凋亡作用，shRNA介導Mcl-1基因沉默可導致HepG2細胞凋亡。靶向Mcl-1基因的RNA干擾可能是肝癌治療的有效途徑之一。

1.5 CED-9

線蟲作為一種模式生物是動物細胞凋亡研究的極好材料。CED-9是Bcl-2抗凋亡蛋白家族中的成員，是調控線蟲細胞凋亡的關鍵蛋白質。通過與促凋亡蛋白CED-4結合，對CED-4在細胞內的定位產生影響，從而改變下游的CED-3的活性，最終調控細胞凋亡。同時，CED-9自身的活性受到另一種促凋亡蛋白EGL-1的調控，EGL—1誘導CED-9的構象發生變化，兩者形成穩定的復合物，同時CED-4從CED-9上脫離并釋放到細胞質中，進而激活CED-3，使細胞發生凋亡。

2 促凋亡蛋白

2.1 Bcl-rambo

Kataoka等發現了Bcl-2家族蛋白的一個新成員：Bclrambo,它和Bcl-xL一樣也具有與Bcl-2同源的四個保守結構域(BH1、BH2、BH3和BH4),但與Bcl-2和Bcl-xL不同的是,Bclrambo 沒有抗凋亡活性,而具有促凋亡活性［14］。

2.2 Bid

Bid蛋白是Bcl-2家族中促凋亡類的蛋白。它具有可被caspase 8酶切調控、高效地誘導細胞色素c從線粒體泄漏到胞漿中的功能,從而在細胞凋亡中起著重要的作用,因而倍受人們的重視。腸腺癌組織的凋亡細胞凋亡水平的降低，蛋白Bid的低表達和Bid/Bcl-xL比值的降低可能在小腸腫瘤的發生和發展過程中發揮重要的作用［15］。Bid基因定位于人染色體22q11,在大多數組織均有表達。正常細胞中Bid蛋白以未活化形式存在于胞漿中,細胞凋亡時,死亡受體途徑中激活的caspase-8剪切掉其N端的氨基酸,使其活化成tBid,可與Bcl-2家族中的Bax、Bak相互作用,增效Bax、Bak調控線粒體膜通透性的作用,促進細胞色素C釋放,促進細胞凋亡［16-18］。在細胞凋亡死亡受體途徑中發揮非常重要的作用,也是聯系死亡受體途徑和線粒體途徑的橋梁。

2.3 Bax

Bax是一種Bcl-2家族的前凋亡蛋白，一般出現在胞漿中，并作為一種細胞損傷和刺激的傳感器。響應損傷和刺激，Bax將重新定位于線粒體表面并破壞在正常狀態下抗凋亡的Bcl-2蛋白的功能［19］。一般來說，在胞漿中的Bax以單體形式存在，然而在細胞發生凋亡時，與線粒體關聯的Bax既可能以無活性的單體形式存在，也可能以與線粒體膜結合的大分子量的活性復合物形式存在。Bax可以構成跨線粒體外膜的孔，并導致膜電位的降低和細胞色素C（Cyt C）及凋亡誘導因子（AIF）的外流，從而引起凋亡［20］。Bcl-2與Bax基因均與大腸腺癌的細胞凋亡的調控有關，在此過程中二者也相互作用，并且可能在大腸腺癌分化的中晚期共同調控，以抑制細胞凋亡作用為主。大腸腺癌中的細胞凋亡與腫瘤的惡性程度有關，惡性程度越大，細胞凋亡越少；Bcl-2與Bax基因均與大腸腺癌的細胞凋亡的調控有關，在此過程中二者也相互作用，并且可能在大腸腺癌分化的中晚期共同調控，以抑制細胞凋亡作用為主［21-22］。

2.4 Bak

Bak和Bax有相似的結構，之前研究人員一直認為它們在細胞凋亡過程中發揮主要的、相似的作用［23］。這兩種蛋白對線粒體損傷和隨后的細胞凋亡非常重要。Bak和Bax在細胞中很有可能其它蛋白控制在正常，當某些事情超出了細胞的控制能力時，Bax和Bak被激活，啟動細胞死亡。某些類似蛋白（最大的是細胞色素C）是線粒體日常工作如產能所必需的，但如果從線粒體中釋放出來，會啟動細胞凋亡［24］。研究人員觀察促進細胞凋亡的Bak蛋白與抑制細胞凋亡的Bcl-xL蛋白對胰腺癌發生、進展、轉移及預后的影響。得出：Bak蛋白的表達與細胞凋亡呈正相關趨勢，Bcl-xL則呈負相關趨勢。細胞凋亡主要影響胰隙癌的發展、轉移及預后。Bak蛋白可作為胰腺癌預后評估的一項指標和一種抗癌基因有望用于胰腺癌治療［25-26］。

2.5 Bcl-xS

Bcl-2和Bcl-xS可通過抑制Bcl-2的功能而起到促細胞凋亡作用。Bcl-xS基因在體內有誘導細胞凋亡的作用。Bcl-xs能顯著增加鼻咽癌CNE－2Z細胞對順鉑誘導凋亡的敏感性［27］。

2.6 Bad(Bcl-xl/Bcl-2相關死亡蛋白)

Bad作為一種新發現的Bcl-2家族凋亡促進基因,其被認為是連接胞內存活/凋亡信號與線粒體凋亡機制的重要因子,故在腫瘤發生中所起的作用一直受到重視。研究表明在正常細胞中,Bad分布在胞質，當有凋亡信號時,Bad轉位到線粒體,與Bcl-xl或者Bcl-2結合形成異二聚體,滅活Bcl-2和Bcl-XL抗凋亡效應,從而促進細胞凋亡。Bad是首先從鼠的cDNA文庫克隆鑒定出的促凋亡基因,其后又克隆出人的同源基因,它屬于bcl-2家族成員。它存在Bcl-2家族成員BH3同源結構域和序列。與Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-xL相似,BH3結構域是Bad與Bcl2家族蛋白結合所必需的,突變的Bcl-2和Bcl-xL不能與Bax、Bak 結合,而Bad卻可以與它們結合［28-30］，在Bcl-2和Bcl-xL過表達的情況下,Bad可直接誘導凋亡,具有治療意義［31-32］。

2.7 Bik

Bik能誘導腫瘤細胞的凋亡，Bik主要通過細胞內凋亡信號通路介導細胞凋亡,Bik過表達導致細胞發生凋亡。線粒體在細胞凋亡發生過程中,起著關鍵的作用,也一直是凋亡研究的重點。本研究也證實,Bik引起線粒體膜電位發生極化,并促使線粒體膜間隙的CytC的釋放。線粒體介導的凋亡信號通路過程中,起始信號即線粒體膜通透性的改變導致Cyt C的釋放,Cyt C同其他凋亡相關分子形成凋亡小體,該小體促使caspase-9前體的剪切,產生具有酶活性的caspase-9。內質網介導的凋亡信號通路在Bik誘導的凋亡中的作用通過構建Bik和EGFP融合蛋白:PCDNAEGFP-Bik(表達EGFP-Bik融合蛋白和PCDNA-EGFP-Bik(表達的EGFP-Bik融合蛋白不含Bik的跨膜結構域)。鈣離子信號可能是Bik定位于內質網后,一個重要的第二信使,進而傳遞下游的凋亡信號。Bik主要從內質網發動凋亡信號,而caspase-12可能是內質網鈣離子釋放引起的下游信號。

2.8 Bim

Bim是Bcl-2家族中僅含有一個BH3結構域的蛋白，具有助凋亡活性，Bim直接激發糖皮質激素（GC）誘導的急性淋巴細胞白血病（ALL）細胞的凋亡，與ALI.對GC的敏感性有關，Bim的下調可能是ALL GC耐藥的重要機制之一。Bim是蛋白酶體抑制劑bortezomib抗腫瘤活性的介質之一，用Bim基因表達載體轉染腫瘤細胞有可能成為腫瘤基因治療的新途徑。

總之，細胞凋亡的分子機制很復雜，Bcl-2 家族在細胞凋亡機制中發揮著不可忽視的作用。對它的研究有利于揭示很多疾病的機制，如腫瘤、老年癡呆、艾滋病、自身免疫病等。也可以根據凋亡理論為腫瘤、老年癡呆、自身免疫病和艾滋病尋找新的有效的藥物。

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