酶標檢測異常結果原因分析及應對

劉自安 徐戰鋒

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是目前血站實驗室最常用的免疫學檢測方法，由于其試劑穩定，易保存，操作簡便，結果判斷較為客觀［1］，既適宜于大量血液篩查，又可用于少量標本的檢測。ELISA試驗以其靈敏度較高、特異性較強，重復性較好等特點在臨床上得到了廣泛的應用，但影響試驗檢測效果的因素也較多，現就本人在實驗操作過程中常見的影響因素進行分析與描述，以提高ELISA檢測質量和水平。

1 異常結果描述

1.1 白板

顯色步驟結束后，酶標反應板所有孔均無顏色。

1.2 顯色弱，靈敏度低

1.2.1 實驗結束后，包括陽性對照、室內質控在內的所有板孔顏色均較淡。

1.2.2 實驗結束后，陰陽性對照正常，室內質控正常，但血液標本感覺顯色較弱。

1.2.3 實驗結束后，陰陽性對照正常，但室內質控品或個別弱陽性標本未能檢出。

1.2.4 終止完成后，目測結果正常，但酶標儀讀值偏低，甚至出現多孔負值。

1.3 靈敏度過高，酶標板本底偏高

1.3.1 終止完成后，整板結果呈現均一的淡黃色或陰陽性對照、質控均正常，但陰性標本OD值過高。

1.3.2 出現隨機性的花板及跳孔現象。

1.4 假陽性

假陽性現象是一個綜合現象，可參考上述1.3 中的分析與描述。

2 原因分析

2.1 白板

2.1.1 試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用。

2.1.2 錯加、漏加試劑組分。

2.1.3 洗板及加樣過程中，酶結合物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力導致。

2.2 顯色弱，靈敏度低

2.2.1 接近或超過有效期的試劑可能會產生很弱的信號。

2.2.2 試劑組分用前未平衡至室溫。

2.2.3 加入試劑的量和順序有誤。

2.2.4 洗板及加樣過程中，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力導致。或者顯色液受到污染。

2.2.5 孵育時間及孵育溫度未達到規定要求。

2.2.6 洗板次數過多，或濃縮洗液稀釋倍數不符合要求，或者用其他廠家洗液洗板，導致靈敏度偏低。

2.2.7 未達到要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強陽性標本，但弱陽性標本受溫度變化影響較大而被未檢出。

2.2.8 室內質控品高溫放置過久或被反復凍融，致使待測物滴度下降，而未能檢出。

2.2.9 酶標儀參數設置不正確或濾光片不匹配。

2.3 靈敏度過高，酶標板本底偏高

2.3.1 整板出現“黃板”現象

2.3.1.1 錯加其他試劑造成或盛放顯色劑容器受到污染。

2.3.1.2 顯色劑在光照條件下放置過久，實驗前已變藍。

2.3.1.3 孵育溫度過高或孵育時間過長。

2.3.1.4 未按要求洗板，如用自來水沖洗或者非本公司洗液洗板，特別是洗滌時每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現象。

2.3.2 酶標板呈現“花板”現象

2.3.2.1 血液標本的采集、處理和保存方法不當造成。

2.3.2.2 加樣時造成的交叉污染、手工洗板造成的交叉污染、手工拍板時造成的交叉污染以及洗板機某幾個加液頭堵塞等均可導致“花板”出現。

2.4 假陽性

2.4.1 計算Cutoff 值時使用的公式不正確，導致計算得出的Cutoff值過低，從而導致假陽性出現。

2.4.2 洗板時板孔未能注滿洗液或洗板次數、浸泡時間不夠，未用試劑盒提供的洗液洗板,導致花板、跳孔，以致假陽性增多。

2.4.3 血液標本處理不當，如標本離心不徹底未完全除去細胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物等，可出現孔底由點變藍的跳孔現象，此標本重復實驗結果往往呈陰性反應。

2.4.4 廠家試劑本身的質量變化造成的假陽性。

3 解決方法（對策）

3.1 白板

3.1.1 每次實驗前應檢查試劑各組分及批號，確認試劑未過期。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。

3.1.2 嚴格按試劑說明書進行規范操作，錯加或漏加試劑組分將會出現白板的異常結果。加完試劑后可目視一下液面高度是否一致，以避免漏加現象。

3.1.3 疊氮鈉等酶抑制物會使酶標記物失活，應確認盛酶標的容器不含酶抑制劑，確認配制洗液的容器已洗干凈，確認配制洗液用的純化水達到要求且未受到污染。

3.2 顯色弱，靈敏度低

3.2.1 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認試劑未過期。

3.2.2 從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應置室溫平衡30min。

3.2.3 確定所使用的每一種試劑加樣量準確，且加入順序適當。

3.2.4 酶免實驗中的標本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用proclin、硫柳汞等其他防腐劑。

3.2.5 孵育溫度和時間應滿足試劑使用說明書規定的要求。

3.2.6 嚴格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，如濃縮洗液稀釋倍數、洗滌次數、浸泡時間等。必須用試劑廠家提供的洗液進行洗板。

3.2.7 標本若需在一周內進行檢測的，可暫存于2～8℃，如需長期保存，應置于-20℃以下保存。室內質控品應置于-20℃以下保存，避免反復凍融。

3.2.8 檢查儀器是否設定正確，特別是檢查濾光片是否匹配。必要時重新設定酶標儀的參數，如有懷疑，可重做實驗。

3.3 靈敏度過高，酶標板本底偏高

3.3.1 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認所有組分均屬于對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。

3.3.2 避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器干燥潔凈。

3.3.3 顯色劑A和B未使用前應避光保存。

3.3.4 孵育溫度和時間應滿足試劑說明書規定的要求。

3.3.5 嚴格按試劑說明書要求洗板。洗滌時每孔均注滿洗液，洗滌次數，每次浸泡時間應嚴格掌握。

3.3.6 待檢標本的處理方法:室溫下自然放置1~2h再用3000r/min離心15min備用［2］。

3.3.7 加標本時應避免交叉污染。如盛標本的試管周圍常有血痂，易脫落，應遠離酶標板。

3.3.8 手工洗板時第一次注洗液后應立即棄去，后幾次再設定浸泡時間，可減少交叉污染。

3.3.9 確保加液頭疏通，洗板時每孔均應注滿洗液，洗板完畢拍板時應選用合適的吸水紙巾，不可把無關物質拍進板孔，并盡量不要在同位置拍打，以免交叉污染。

3.4 假陽性

3.4.1 Cutoff值計算公式應嚴格參照試劑說明書設置（不同廠家的Cutoff值計算公式不盡相同）。

3.4.2 嚴格按說明書要求洗板（不同廠家的試劑洗滌次數、浸泡時間不盡相同）。調整洗板機時，應注意有時儀器標示的液量與實際液量并不相符，應根據實際情況調整至每孔注滿。

3.4.3 待檢測標本應放置4℃冰箱保存或新鮮標本及時檢測［3］。

3.4.4 當國家標準要求提高靈敏度時，廠家試劑的靈敏度也相應提高，假陽率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的。

4 討論

全自動酶免分析儀在血站實驗室的普及，極大地促進了酶免疫測定技術的臨床應用，實現了ELISA檢測的標準化、減輕了實驗室技術人員的勞動強度，提高了臨床免疫測定的質量和水平［4］。無論怎樣先進的儀器都離不開人的操作，再先進儀器也不能解決工作中出現的一切問題，ELISA檢測結果的正確與否對血站來說至關重要，一方面，假陽性結果會浪費寶貴的血液資源，另一方面，假陰性結果則不能確保臨床用血的安全。因此我們在實際操作中只有正確掌握影響ELISA試驗檢測效果的各類因素及其解決辦法，才能更好地操作儀器，提高血液檢測質量，確保臨床用血安全。

［1］李楚潮.ELISA,RPR、Trust、TPPA四種方法檢測梅毒螺旋體抗體的結果分析［J］.當代醫學，2010,16（20）：9-10.

［2］中國疾病預防控制中心.全國艾滋病檢測技術規范［S］.2004,08:1.

［3］石凌波，崔偉歷，張鳳川.檢驗醫學分析前質量控制［M］.北京：人民衛生出版社，2009,08:246

［4］李金明主編.臨床酶免疫測定技術學［M］.北京：人民軍醫出版社，2005,05:148