海帶中巖藻多糖的分離純化與結構分析

張文清，左萍萍，徐 辰，楊 蕾，張玉龍，夏 瑋

(華東理工大學化學與分子工程學院，上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237)

海帶中巖藻多糖的分離純化與結構分析

張文清，左萍萍，徐 辰，楊 蕾，張玉龍，夏 瑋*

(華東理工大學化學與分子工程學院，上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237)

通過DEAE-纖維素和凝膠過濾色譜反復柱層析，采用苯酚-硫酸法和高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)檢測，從提取的海帶巖藻多糖中得到了均一多糖TC-1，并結合多種分析手段：包括糖組成分析、甲基化分析、紅外光譜(IR)分析等對其化學結構進行測定。結果表明：TC-1重均相對分子質量(Mw)為3.7×105，主要由巖藻糖構成，此外還伴有少量的木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的結構復雜的硫酸酯多糖。其中巖藻糖糖基以1,4-、1,3-連接方式存在；木糖以1,3-連接方式存在；甘露糖以1,3-、1,6-連接方式存在；葡萄糖以1,3,4-、1,2,4,6-連接方式存在；半乳糖以1,6-、1,3,6-、1,3,4,6-連接方式存在。

海帶；巖藻多糖；分離純化；結構分析

海帶具有很高的食用、藥用價值。研究表明，海帶所含的巖藻多糖具有明顯的生理活性，如抗腫瘤、促進造血功能等[1-2]。隨著人們對巖藻多糖的深入研究，得知其并非單一結構的化合物，其組成十分復雜，稱為含巖藻糖的硫酸多糖(fucose-containing sulfated polysaccharides)。由于巖藻多糖的含量和結構受多種因素影響[3]，目前國內外的報道對其結構組成沒有統一的定義，大多是對其進行初步純化[4]，得到巖藻多糖的混合物。國外部分學者對巖藻多糖的結構進行了研究[4-6]，但海帶的深度開發卻涉及較少。本研究利用我國資源豐富的海帶，綜合各種分離手段，得到均一多糖組分，并鑒定了它的一級結構，旨在為今后巖藻多糖的開發利用提供技術資料和結構信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶產自山東威海。

DEAE-纖維素 美國Whatman公司；Sephacryl S-300、S-200凝膠層析介質 美國Pharmacia公司；標準葡聚糖 美國Fluka公司；透析袋(截留相對分子質量1000) 上海綠鳥科技公司；纖維素板 上海市藥品檢驗所；單糖對照品 美國Sigma公司；無水二甲亞砜、無水硫酸鈉、碘甲烷 國藥集團化學試劑有限公司；三氯甲烷 上海化學試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TL-5.0臺式離心機 上海市離心機械研究所；BT-100恒流泵 上海市滬西分析儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；SBS-100數控計滴自動部分收集器 上海市青浦滬西儀器廠；玻璃層析柱 上海市亞榮生化儀器廠；R-201型旋轉蒸發儀 上海申科機械研究所；FD1冷凍干燥機 北京博醫康儀器有限公司；vario EL Ⅲ型元素分析儀 德國Sartorius Gmbh公司；Agilent1100高效液相色譜儀、Agilent 6890 5975氣質聯用儀(色譜柱為HP-5型毛細管柱) 美國安捷倫有限公司；Nicolet Magna-IR550紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.3 海帶中巖藻多糖的提取[7-8]

取潔凈干燥的海帶50g，粉碎后用無水乙醇浸泡，脫脂后的固體殘渣用水提取(料液比1:10(m/V)，60℃提取2h)，提取3次，合并提取液，離心，濃縮上清液至小體積，加入無水乙醇，至所含乙醇的體積分數為3 0%，過濾，上清液再加無水乙醇至其體積分數為60%，離心收集沉淀，真空干燥得巖藻多糖粗品。

將巖藻多糖配成5g/100mL的水溶液，用CaCl2對其進行初步純化。溶液中加入4mol/L CaCl2，離心后取上清液，加乙醇至其體積分數為65%，用乙醇和丙酮浸洗沉淀，40℃干燥得到巖藻多糖。

1.4 巖藻多糖的分離純化[9]

稱取2g巖藻多糖溶于20mL去離子水，經DEAE-纖維素柱(1.5cm×50cm)初步分離。依次用去離子水和0.6、1.0、2.0mol/L NaCl溶液洗脫，洗脫流速為2mL/min，采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，以洗脫體積為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線。將各部分洗脫液分別減壓濃縮至適當體積，對蒸餾水透析，透析袋內液冷凍干燥得F-A、F-B、F-C、F-D。用Sephaeryl S-300凝膠層析柱(1.6cm×80cm)進一步分離F-C，同時用苯酚-硫酸法和高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)進行檢測，最終得到均一多糖組分TC-1。

1.5 多糖純度及其相對分子質量分布測定

采用高效液相凝膠過濾色譜法(HPGFC)。樣品及系列標準多糖(不同相對分子質量的葡聚糖：Mw分別為11600、66700、123600、196300、500000)分別流經Agilent1100高效液相色譜系統中TSKG 5000PWXL色譜柱，流動相為0.1mol/L NaNO3溶液，流速為0.5mL/min，示差折光檢測器檢測。由標準多糖的相對分子質量對數與保留時間做標準曲線，根據標準曲線及Agilent GPC軟件計算樣品相對分子質量及分布，樣品純度由峰型判斷。

1.6 單糖組成分析[10]

取多糖樣品2～3mg置于5mL安瓿瓶中，加2mol/L三氟乙酸(TFA)2mL，封管，120℃水解2h。旋蒸除盡溶液中的TFA，之后加入少量蒸餾水，取5μL進行薄層分析。用乙酸乙酯、吡啶、水、乙酸(體積比為5:5:3:1)的混合液展開劑展開后，苯胺-鄰苯二甲酸顯色，所得結果與標準單糖對照。水解產物另一部分，室溫下加入NaBH4，反應2h(間隙振蕩)，生成糖醇乙酰酯衍生物，進行GC-MS分析。以標準單糖的糖醇全乙酰化衍生物(制備方法同多糖樣品，但勿需TFA水解)作對照。分析條件：Agilent 6890 5975 GC-MS；色譜柱型號：HP-5色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；分流比20:1；進樣量0.2μL；采取程序升溫：初始溫度/停頓時間為150℃/2min；程序升溫終止溫度/停頓時間為220℃/10min；升溫速率5℃/min。

1.7 甲基化分析

根據Needs等[11]法對多糖樣品進行甲基化，IR檢測產物無羥基特征吸收峰，表明其甲基化完全。將完全甲基化的多糖樣品溶于90%甲酸水溶液，密塞，100℃水浴解聚6h，除盡甲酸后，加入2mol/L TFA，120℃密封水解2h后除去過量TFA。固體殘渣經NaBH4還原、乙酰化制得部分甲基化的阿爾迪醇乙酸酯衍生物，進行GC-MS分析。分析條件：Agilent 6890 5975 GC-MS；色譜柱型號：HP-5色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；分流比3:1；進樣量1μL(氯仿為溶劑)；采取程序升溫：初始溫度/停頓時間為120℃/2min；程序升溫終止溫度/停頓時間250℃/10min；升溫速率5℃/min。

1.8 紅外光譜(IR)分析及元素分析

取1～2mg樣品，KBr研磨壓片后進行IR分析，甲基化后的樣品采用衰減全反射ATR附件測定IR吸收。采用IR吸收法、vario EL Ⅲ型元素分析儀檢測樣品是否含有硫酸根及硫酸根的含量。

2 結果與分析

2.1 TC-1的分離純化

圖1 巖藻多糖的DEAE-纖維素柱色譜分離Fig.1 Elution pattern of crude polysaccharides extracted from kelp on DEAE-cellulose column

如圖1所示，各部分洗脫液分別減壓濃縮至適當體積，用蒸餾水透析，透析袋內液冷凍干燥所得產物，分別命名為F-A、F-B、F-C、F-D，4個組分多糖總量分別為35、610、690、18mg。

多糖的純度不能以通常小分子化合物的純度標準來衡量，因為多糖是一種生物高分子化合物，其存在微觀不均一性。多糖的純度代表是某一多糖的相似鏈長的平均分布。目前通常采用高效液相凝膠過濾色譜法(HPGFC)對多糖進行純度檢測。一般來說，在凝膠柱填料的排阻極限內，HPGFC譜中呈現窄的單一對稱峰的多糖組分可被認為是均一多糖。檢測結果表明，F-A、F-B、F-C、F-D都不純，均需要進一步分離純化才能得到均一多糖。本實驗僅對F-C部分作進一步分離純化，色譜圖見圖2。

圖2 F-C的凝膠過濾色譜圖Fig.2 Gel filtration chromatogram of F-C

根據GPC軟件計算可知F-C部分可能含有兩種多糖組分，根據其相對分子質量分布，選擇Sephacryl S-300作為凝膠層析介質(1.6cm×80cm)進行純化。采用苯酚-硫酸法和HPGFC同時進行檢測，得到均一多糖TC-1，其色譜圖見圖3。以已知相對分子質量的標準葡聚糖制作校正曲線，根據多糖樣品的保留時間，由GPC軟件計算出TC-1的重均相對分子質量Mw為3.7×105，數均相對分子質量Mn為3.0×105。

圖3 TC-1的凝膠過濾色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatogram of TC-1

2.2 TC-1的紅外光譜分析

由圖4可知，3421cm-1處強吸收峰為O-H伸縮振動峰；2926cm-1為C-H的伸縮振動吸收峰；1645cm-1處為糖環的伸縮振動峰；1258cm-1附近處是由硫酸基S＝O伸縮振動引起的，證明了TC-1是含有硫酸基取代的多糖；1084cm-1處為C-O的伸縮振動峰；848cm-1為C-O-S(直立鍵)的伸縮振動峰，硫酸基連接在糖環的C4位上；此外在1720cm-1附近未檢測到吸收峰，說明不含有糖醛酸；在810cm-1及870cm-1處無吸收，說明可能不含甘露糖[12]。

圖4 TC-1的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of TC-1

2.3 TC-1單糖組成分析

TC-1以2mol/L TFA 120℃水解后的產物進行纖維素薄層層析(TLC)，以標準單糖為對照，苯胺-鄰苯二甲酸噴霧顯色后顯示有巖藻糖(棕色斑點)﹑木糖(紅色斑點)、甘露糖(紅色斑點)、半乳糖(棕色斑點)和葡萄糖(棕色斑點)的存在，另外，在Rf值等同于標準半乳糖醛酸的位置處未發現紅棕色斑點，說明TC-1不含有半乳糖醛酸成分，與上述的紅外結果一致。

圖5 TC-1的總離子流圖Fig.5 GC-MS total ion current chromatogram of TC-1

為證實TLC的結果，另取TC-1用2mol/L TFA120℃水解2 h，經硼氫化鈉還原，乙酸酐乙酰化后，衍生物進行GC-MS分析，如圖5所示，通過與標準單糖相應衍生物的保留時間(圖6)比較，得知TC-1主要含有巖藻糖，伴有少量的木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質的量比為17.3:1.0:2.6:3.8:5.1。通過IR測定，1240cm-1吸收峰是S＝O伸縮振動特征吸收峰，830cm-1是C-O-S振動的特征頻率[13]，元素分析法測得的硫酸基含量為22.4%，印證了巖藻多糖是含有相當數量的巖藻糖(fucose)和硫酸基的多糖[14]。

圖6 標準單糖衍生物的總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of mixed standard monosaccharides

2.4 TC-1的甲基化分析

TC-1完全甲基化產物經90%甲酸解聚、TFA水解、硼氫化鈉還原及乙酰化后制得部分甲基化的阿爾迪醇乙酸酯衍生物后進行GC-MS分析，結果見表1。

表1 TC-1甲基化分析結果Table1 Methylation analysis of reduced TC-1

由表1可知，巖藻糖殘基存在1,4-、1,3-兩種連接方式，主要以1,3連接方式為主；木糖殘基以1,2-連接方式存在；甘露糖有1,3-、1,6-兩種連接方式；葡萄糖存在1,3,4-、1,2,4、6-兩種連接方式；半乳糖有1,6-、1,3,6-、1,3,4,6- 3種連接方式。

綜合以上的分析結果，TC-1為重均相對分子質量為3.7×105，硫酸基含量為22.4%，由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的復雜硫酸酯多糖。其中巖藻糖糖基以1,4-、1,3-的連接方式存在；木糖以1,3-連接方式存在；甘露糖以1,3-、1,6-連接方式存在；葡萄糖以1,3,4-、1,2,4,6-連接方式存在；半乳糖以1,6-、1,3,6-、1,3,4,6-連接方式存在。

3 討 論

關于海帶中巖藻多糖的組成[15]國內外已有報道。程忠玲[13]報道海帶中提取的褐藻糖膠為一種水溶性雜聚糖，其主要原始成分是L-巖藻糖-4-硫酸酯，以及少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白質和鉀、鈉、鈣、鎂等金屬離子。L-巖藻糖-4-硫酸酯的結構特征是1,2-連接的聚α-L-吡喃巖藻糖。主鏈由巖藻糖組成，在巖藻糖上含有大量的硫酸基。李林等[16]研究發現海帶中的褐藻糖膠是由鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fvc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glu)、葡萄糖醛酸、硫酸根及蛋白質構成的復合物，其中單糖的物質的量比為Rha:Fuc: Xyl: Man: Gal: Glu=0.41:1.72:3.75:0.96:1:2.17。褐藻糖膠的葡萄糖醛酸、硫酸根及蛋白質的含量分別為6.2%、8.7%和4.1%。與這些報道相比，本實驗從海帶中獲得的TC-1的單糖組成與它們有所不同，為其在生物活性多樣性方面[17]的研究應用提供了基礎。

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Isolation, Purification and Structural Analysis of Fucoidan from Kelp

ZHANG Wen-qing，ZUO Ping-ping，XU Chen，YANG Lei，ZHANG Yu-long，XIA Wei*
(Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

A homogeneous polysaccharide named as TC-1 was obtained from kelp by DEAE-cellulose and gel filtration chromatography. Its chemical structure was characterized by means of monosaccharide composition analysis, methylation analysis and IR spectroscopic analysis. TC-1 was a complex sulfated polysaccharide with a weight-average molecular weight of 3.7 × 105. TC-1 mainly consisted of fucose and small amounts of xylose, mannose, glucose and galactose were also found. The chain of TC-1 included 1,4-linked or 1,3-linked fucose, 1,3-linked xylose, 1,3-linked or 1,6-linked mannose, 1,3,4-linked or 1,2, 4,6-linked glucose, and 1,6- linked,1,3,6- linked, or 1,3,4,6- linked galactose.

kelp；fucoidan；isolation and purification；structural analysis

O636.1

A

1002-6630(2012)01-0068-04

2011-01-14

張文清(1969—)，女，教授，博士，主要從事天然產物及功能材料的研究。E-mail：zhwqing@ecust.edu.cn

*通信作者：夏瑋(1976—)，女，副教授，博士，主要從事天然產物的研究與開發。E-mail：xiawei1999@ecust.edu.cn