具有廣譜抑菌活性乳酸菌的篩選及抑菌物質分析

馬妙蓮，趙 靜，陳曉琳，張付海，朱 敏，張 明,*

(1.安徽農業大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；2.安徽省環境監測中心站，安徽 合肥 230036)

具有廣譜抑菌活性乳酸菌的篩選及抑菌物質分析

馬妙蓮1，趙 靜1，陳曉琳1，張付海2，朱 敏2，張 明1,*

(1.安徽農業大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；2.安徽省環境監測中心站，安徽 合肥 230036)

采用雙層平板法從食用小米中分離出一株對實驗所測的革蘭氏陽性菌、陰性菌和霉菌有明顯抑制作用的菌株，通過生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性分析，確定該菌株為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)。經氣相色譜-質譜聯用儀和高效液相色譜初步分析該菌株發酵上清液中含有乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸和亞油酸等多種抑菌成分。

乳酸菌；抑菌；有機酸

食品在生產、加工和儲存過程中極易受各種微生物的污染，從而導致食品變色、變味、腐爛發霉，特別是霉菌產生的霉菌毒素，極易引起人畜急性和慢性中毒，若長期食用會出現致癌和致畸現象[1]。另外食源性致病細菌也會引發各種疾病的發生，嚴重危害人類健康。為了延長食品的貨架期，添加防腐劑是一種方便、有效的食品防腐方法，但目前普遍使用的化學防腐劑存在著體內殘留、有一定的毒性和特殊氣味等問題，因此開發廣譜、高效、低毒的天然生物型食品防腐劑成為食品工業中重要的研究領域之一。

乳酸菌是廣泛應用于食品、醫藥和飼料等行業的一類重要工業微生物，研究表明乳酸菌可以產生有機酸、過氧化氫、雙乙酰、酶和細菌素等抑菌物質，從而抑制食品腐敗菌、食源性致病菌[2-5]以及霉菌的生長，乳酸菌還具有阻止霉菌毒素形成和清除的功能[6-9]。乳酸菌廣泛分布于自然界，特別是動物、植物和發酵食品中，這些乳酸菌大多可以產生抑菌物質，這為研究開發安全的食品防腐劑提供了根本的保障。本研究擬從食用小米中篩選對革蘭氏陽性菌、陰性菌和霉菌具有明顯抑制作用的菌株，并對其進行鑒定和抑菌物質的初步分析，以為進一步研究開發生物防腐、防霉劑提供有價值的菌種資源。

1 材料與方法

1.1菌株與培養基

檢測菌：本實驗分離產酸菌，分離自山西應縣農家食用小米。

指示菌：金黃色葡萄球菌、四聯球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、雞白痢沙門氏菌、黃曲霉、蘋果炭疽病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌由安徽農業大學微生物實驗室保藏。藤黃微球菌、英諾克李斯特菌、單核增生李斯特菌 由廣東省微生物研究所保藏。

培養基[10-13]：MRS培養基、菌種鑒定培養基、PDA培養基和LB培養基。

1.2 試劑與儀器

甲醇(色譜級) 上海凌峰化學試劑有限公司；硫酸上海振企化學試劑有限公司；氯化鈉、硫酸鈉、UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SK2072即用型PCR擴增試劑盒 上海生工生物工程技術服務有限公司；二氯甲烷 國藥集團化學試劑有限公司。

GC-MS QP 2010 Plus氣相色譜-質譜聯用儀、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；PCR擴增儀 珠海黑馬醫學儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 產酸菌的分離純化及發酵濃縮液的制備

小米加入自來水富集培養半個月后，取富集液200μL涂布于含有溴甲酚紫的MRS培養基上，37℃培養，挑取能使培養基變黃的菌株，即為產酸菌，進一步采用劃線法分離純化。

將各分離出的產酸菌分別接種到新鮮的MRS液體培養基中，37℃靜置培養36h，4℃、9000r/min離心15min，倒出上清液即為發酵上清液，將其旋轉蒸發，濃縮10～15倍制成濃縮液，4℃冰箱保存。

1.3.2 產抑菌物質菌株的篩選

制備黃曲霉孢子懸液[8]，取孢子懸液100μL與7mL 50℃左右的PDA半固體培養基混合，立刻倒在含有2%瓊脂的素瓊脂培養基上[14]，凝固后放上牛津杯。取200μL濃縮液注入牛津杯，28℃培養約35h，觀察是否出現抑菌圈。設相同處理的MRS培養基作為對照。

1.3.3 菌株的鑒定

通過生理生化特性[11-12]和16S rRNA 基因序列同源性分析鑒定菌株[15]。

同源性比較：將PCR擴增產物的序列在NCBI網站上用Blast軟件搜索相似序列，經ClustalX序列比對后，用Mega4.1程序構建系統進化樹，自展值(bootstrap)為1000。

1.3.4 發酵濃縮液對黃曲霉孢子萌發的影響

將100μL黃曲霉孢子懸液和1mL發酵濃縮液同時加到5mL液體PDA培養基中。28℃、130r/min振蕩培養，顯微鏡觀察孢子萌發狀況。設未加濃縮液的液體PDA培養基作為對照。

1.3.5 抑菌作用的測定

抑菌譜測定中對霉菌的抑菌活性檢測方法參見1.3.2節；對細菌抑菌活性的檢測方法參見文獻[18-19]。

1.3.6 產酸菌LPEM818所產抑菌物質性質的分析

1.3.6.1 高效液相色譜對發酵液中有機酸成分的分析

將1mL發酵上清液經0.22μm針筒式水膜過濾后，稀釋10倍作為樣品。采用島津高效液相色譜儀對發酵液中有機酸成分進行分析。VA-ODS液相色譜C18柱 (250mm× 4.6mm，5μm)。以2.5mmol/L NH4H2PO4(含1%甲醇) 溶液(pH2.5)為流動相，流速為0.5mL/min，柱溫30℃，Prominence SPD-M20A PDA檢測器，檢測波長為210nm；進樣10μL進行檢測。

1.3.6.2 氣相色譜-質譜聯用儀對發酵液中有機酸成分的分析

將5mL發酵上清液加到具有磨口塞的150mL錐形瓶中，再加入50mL10%硫酸甲醇溶液，密閉，60℃水浴恒溫酯化2h[16]。用濾紙將酯化液過濾到分液漏斗中，用15mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液。萃取液用20mL飽和NaCl溶液洗滌3次[17]，再用無水硫酸鈉脫水，濾出無水硫酸鈉至澄清透明。萃取液置于細口瓶中，取1.0μL進行氣相色譜-質譜分析。

色譜條件：DB-5石英毛細管色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；升溫程序：初始溫度60℃，以8℃/min升至190℃，保持2min；每分鐘2℃升至210℃時保持5min；載氣(He)流速1.0mL/min，進樣量1.0μL；不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度275℃；離子源溫度250℃；質量掃描范圍10～400u；發射電流100mA，檢測電壓1.1kV。

1.3.6.3 混合酸抑菌作用的驗證

配制乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸和亞油酸的混合溶液，使其終濃度分別為10、50、100、200mmol/L，采用牛津杯法測定混合溶液對各指示菌的抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 產抑菌物質菌株的篩選及鑒定

圖1 菌株LPEM818發酵上清濃縮液對黃曲霉的抑制作用Fig.1 Inhibition of Aspergillus flavus by concentrated cell-free fermentation supernatant of strain LPEM818

從小米中篩選到3株產酸菌，其中菌株LPEM818的發酵上清濃縮液對黃曲霉有較強的抑制作用，圖1中孔2和孔4抑菌圈平均直徑為17.0mm，而MRS培養基的濃縮液沒有抑菌作用(圖1孔1和孔3)。

為了明確該菌株的分類學地位，對其進行了形態學、生理生化特性以及16S rRNA基因序列同源性分析。

菌株LPEM818菌體呈短桿狀，革蘭氏陽性；在MRS培養基上菌落呈乳白色，凸起、光滑、邊緣整齊。

生理生化實驗結果表明：菌株LPEM818不還原硝酸鹽，不液化明膠，接觸酶為陰性。能發酵葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、甘露糖、纖維糖、鼠李糖、肌醇、M.R、卵磷脂酶、脂酶實驗均為陽性，V-P、吲哚、淀粉水解實驗均為陰性，牛奶分解酸凝固。

與GeneBank中的菌株進行16S rRNA基因序列同源性分析，結果表明菌株LPEM818的16S rRNA基因序列與戊糖乳桿菌ML34有99%相似性(圖2)。

圖2 以部分16S rRNA序列為基礎構建的菌株LPEM818的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of LPEM818 and related strains based on partial 16S rRNA sequences

依據《伯杰氏細菌分類手冊》[11]、《常見細菌系統鑒定手冊》[12]、16S rRNA基因序列的同源性分析，確定該菌株為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)。

2.2 菌株LPEM818發酵上清濃縮液對黃曲霉孢子萌發的影響

圖3 菌株LPEM818發酵上清濃縮液對黃曲霉孢子萌發的影響Fig.3 Effect of concentrated cell-free fermentation supernatant of strain LPEM818 on the germination of A.flavus spores

將100 μ L黃曲霉孢子懸液和1mL濃縮液同時加到5mL液體PDA培養基中，28℃培養10h后，在加有濃縮液的PDA液體培養基中，黃曲霉孢子呈圓形，未萌發(圖 3A)，而在沒有添加濃縮液的PDA液體培養基中有大量孢子萌發，形成短菌絲(圖3B)。培養2d后，實驗組中孢子仍未萌發，而對照組菌絲生長旺盛(圖3C)，且有孢子浮于液體培養基表面。這一結果說明菌株LPEM818發酵液的濃縮液對黃曲霉孢子萌發有明顯抑制作用。

2.3 抑菌譜

以革蘭氏陽性菌、陰性菌和植物病原菌作為指示菌，采用雙層平板法檢測菌株LPEM818的抑菌譜，結果見表1。

表1 菌株LPEM818的抑菌譜Table1 Antimicrobial spectrum of strain LPEM818

從表1可以看出，菌株LPEM818除了對黃曲霉有一定的抑菌作用外，還對蘋果炭疽病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌有很強的抑菌作用。同時，對測試的細菌也有較強的抑菌作用，其中對四聯球菌和雞白痢沙門氏菌的抑菌作用最強，抑菌圈直徑分別為49.0mm和46.3mm。

2.4 菌株LPEM818所產抑菌物質的分析

采用高效液相色譜分析經處理的菌株LPEM818的發酵上清液，結果見圖4。對照乳酸、乙酸標準溶液的色譜圖可知峰1和峰2分別為乳酸和乙酸，同時還伴有其他有機酸的生成。

圖4 菌株LPEM818發酵上清液的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of cell-free fermentation supernatant of strain LPEM818

進一步采用氣相色譜-質譜聯用儀分析發酵上清液中的有機酸，有機酸甲酯的總離子流色譜圖見圖5。根據標準譜庫檢索確認發酵液中含有琥珀酸、檸檬酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸和亞油酸6種有機酸。

圖5 菌株LPEM818發酵上清液中有機酸分析的總離子流圖Fig.5 Capillary gas chromatographic total ion current profile of organic acids in cell-free

將檢測到的8種酸配制成終濃度為10、50、100、200mmol/L的混合溶液，抑菌實驗表明，終濃度為50mmol/L的混合酸對實驗所測細菌(表1)有抑制作用，對黃曲霉沒有抑制作用。終濃度為100mmol/L的混合酸對黃曲霉有微弱抑制作用，終濃度為200mmol/L的混合酸對細菌抑菌圈直徑達到30mm以上。以上實驗表明各種混合酸對細菌和霉菌的生長都有一定的抑制作用。

有相關文獻報道[20-21]，檸檬酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸及亞油酸等有抑制細菌和真菌生長的作用，與本實驗的結果一致，Lavermicocca等[6]發現植物乳桿菌21B發酵液具有抑制真菌生長的作用，氣相色譜-質譜分析發現發酵液中含有棕櫚酸。Walters等[22]的研究表明亞油酸能抑制Rhizoctonia solani、Pythium ultimum、Pyrenophora avenae 和Crinipellis perniciosa等真菌的生長。Liu Siyun等[23]通過培養皿法觀察到棕櫚酸、油酸及亞油酸等有機酸對植物病原菌Alternaria solani、Colletotrichum lagenarium、Fusarium oχyspo rum f. sp. cucumerinum 和Fusarium oχysporum f. sp. lycopersici均有抑制作用。另外，除了抑制菌絲生長外，棕櫚酸等多種脂肪酸還具有抑制孢子萌發的作用。

3 結 論

本實驗從山西食用小米中分離出一株具有廣譜抑菌活性的戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)菌株LPEM818，其代謝產物對黃曲霉、革蘭氏陽性菌、陰性菌具有較強的抑制作用。經氣相色譜-質譜聯用儀和高效液相色譜分析發現菌株LPEM818的發酵上清液中含有多種具有抑菌作用的有機酸，經驗證可確定該菌產生的抑菌物質主要為各種有機酸的混合物。該菌株的發現為進一步研究開發生物防腐、防霉劑提供了有價值的菌種。菌株LPEM818的發酵上清液中未明確具體成分的峰，還有待進一步研究。

[1]劉付香, 李玲, 梁炫強. 生物防治黃曲霉毒素污染研究進展[J]. 中國生物防治, 2010, 26(1): 96-101.

[2]de MARTINIS E, FRANCO B. Inhibition of foodborne pathogens by bacteriocin-producing Leuconostoc sp. and Lactobacillus sake isolated fromJ]. Revista de Microbiologia, 1997, 28(4): 284-287.

[3]LUDERS T, BIRKEMO G, FIMLAND G, et al. Strong synergy between a eukaryotic antimicrobial peptide and bacteriocins from lactic acid bacteria [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(3): 1797-1799.

[4]HE Zengguo, KISLA1 D, ZHANG Liwen, et al. Isolation and identification of a Paenibacillus polymyχa strain that coproduces a novel lantibiotic and polymyxin[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(1): 168-178.

[5]de CARVALHO K, BAMBIRRA F, KRUGER M, et al. Antimicrobial compounds produced by Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a, a bacteriocinogenic strain isolated from a brazilian meat product[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2010, 37(4): 381-390.

[6]LAVERMICOCCA P, VALERIO F, EVIDENTE A, et al. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(9): 4084-4090.

[7]曹冬梅, 張洪英, 何成華, 等. 彎曲乳酸桿菌 HB02 抑制黃曲霉生長及產毒[J]. 南京農業大學學報, 2008, 31(3): 125-129.

[8]唐雨蕊, 倪學勤, 曾東. 乳酸桿菌對黃曲霉生長抑制的研究[J]. 中國飼料, 2008(5): 42-45.

[9]SMAOUI S, ELLEUCH L, BEJAR W, et al. Inhibition of fungi and gram-negative bacteria by bacteriocin BACTN635 produced by Lactobacillus plantarum sp. TN635[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010, 162(4): 1-15.

[10]凌代文, 東秀珠. 乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1999.

[11]布坎南R E, 吉本斯 N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組, 譯. 北京: 科學出版社, 1984: 797-820.

[12]東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001.

[13]張龍翔, 張庭芳, 李令媛. 生化實驗方法和技術[M]. 北京: 高等教育出版社, 1997.

[14]MAGNUSSON J, SCHNURER J. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(1): 1-5.

[15]盛海圓, 郭艷萍, 常艷, 等. 傳統泡菜中乳酸菌多樣性的分析[J]. 中國微生態學雜志, 2010, 22(7): 580 -582.

[16]朱曉蘭, 高蕓, 蘇慶德. 毛細管氣相色譜法測定番茄中的非揮發性有機酸, 高級脂肪酸和低分子量糖類[J]. 食品科學, 2004, 25(9): 152-157.

[17]賈春曉, 熊衛東, 毛多斌, 等. 拐棗果梗中有機酸成分的GC-MS分析[J]. 中國食品學報, 2005, 5(1): 72-74.

[18]張秀紅, 劉婷婷. 具廣譜抑菌活性乳酸菌的篩選[J]. 乳業科學與技術, 2010, 33(2): 56-59.

[19]SCHILLINGER U, LUCKE F. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55(8): 1901-1906.

[20] SIMPSON C A, SOFOS J N. Antimicrobial Ingredients[M]//TARTE R. Ingredients in meat products: properties, functionality and applications. Berlin: Springer, 2009: 301-377.

[21] AGORAMOORTHY G, CHANDRASEKARAN M, VENKATESALU V, et al. Antibacterial and antifungal activities of fatty acid methyl esters of the blind-your-eye mangrove from India[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2007, 38: 739-742.

[22]WALTERS D, RAYNOR L, MITCHELL A, et al. Antifungal activities of four fatty acids against plant pathogenic fungi[J]. Mycopathologia, 2004, 157(1): 87-90.

[23]LIU Siyun, RUAN Weibin, LI Jing, et al. Biological control of phytopathogenic fungi by fatty acids[J]. Mycopathologia, 2008, 166(2): 93-102.

Isolation of Lactic Acid Bacteria with Broad-Spectrum Antimicrobial Activity and Analysis of Antimicrobial Substances

MA Miao-lian1，ZHAO Jing1，CHEN Xiao-lin1，ZHANG Fu-hai2，ZHU Min2，ZHANG Ming1,*
(1. School of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. Anhui Environmental Monitoring Center, Hefei 230036, China)

A strain with strong inhibitory activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and mold, named as LPEM818, was isolated from Millet by the overlay plate method. The strain was identified as Lactobacillus pentosus by physiological and biochemical characterization and 16S rRNA sequence homology analysis. In the cell-free fermentation supernatant, some antimircrobial substances including lactic acid, acetic acid, succinic acid, citric acid, palmitic acid, oleic acid, stearic acid and linoleic acid were found by GC-MS and HPLC analyses.

lactic acid bacteria；antibacteria；organic acid

Q935

A

1002-6630(2012)01-0162-04

2011-01-28

國家“863”計劃項目(2008AA10Z319)；安徽省高校“十一五”優秀人才計劃項目([教秘人]2004-100)

馬妙蓮(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為作物生物技術。E-mail：mml1986go@163.com

*通信作者：張明(1962—)，女，教授，博士，研究方向為微生物學。E-mail：zhangming@ahau.edu.cn