MTT法測定異搏定聯合化療藥物對膠質瘤細胞U251化療敏感性評估

何國龍 金許洪 尹 劍 馬躍輝 秦福創 葉 欣

腦膠質瘤起源于神經外胚層，是顱內發病率最高、最難治愈的惡性腫瘤，約占所有顱內腫瘤的35% ～61%［1］。盡管有手術、化療和γ刀、X刀等治療方法，但預后依然不佳。從臨床治療效果看，術后輔助化療在膠質瘤的綜合治療中的作用越來越受到重視。本實驗通過MTT法檢測不同時間和劑量的化療藥物對腦膠質瘤細胞U125存活度的變化，來探討異搏定分別聯合化療藥物(阿霉素、長春新堿、足葉乙甙)在不同作用時間點和不同劑量的作用下對膠質瘤化療敏感性的影響，進一步明確化療敏感性的差異。

材料與方法

1.主要材料、試劑與儀器:U251細胞株購于中國科學院細胞研究所，DMEM培養基購于美國Invitrogen公司，阿霉素、長春新堿、足葉乙苷、異搏定購于美國Sigma公司;主要儀器包括:上海精密科學儀器有限公司紫外分光光度儀MC－756，美國SHELDON公司二氧化碳恒溫培養箱TC2323等。

2.組別設置:一共4個組，第1～3組為實驗組和第4組為對照組，具體見表1。

3.細胞培養:將U251細胞置于pH 7.2～7.4的DEME培養基(含10%胎牛血清，青霉素100U/m l，鏈霉素100U/m l)中，待細胞狀態良好后進行鋪板(96well);鋪板，調整細胞濃度為5×104/m l，每孔加100μl細胞懸液。在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養。培養24h，上藥，棄去原培養液，用培養基稀釋藥物，配制成不同濃度的藥物培養液，每孔100μl上藥;倒置顯微鏡下觀察細胞呈貼壁生長，形態良好無退化，待其鋪滿瓶壁70%～80%時，以0.25%胰蛋白酶消化，隔夜換液。對照孔直接換培養基。分別在各時間點(6、12、24、36、48、72h)檢測。

4.MTT法檢測:取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，接種，CO2恒溫培養箱中培養24h后吸出培養液，棄去上清液。設置對照組及異搏定聯合化療組(阿霉素、長春新堿、足葉乙甙)時設置不同時間組(6、12、24、36、48、72h)觀察時效關系。孵育4h每孔加入10μl 5mg/ml的MTT液;37℃恒溫下孵育4h;棄去培養液，每孔加入150μl DMSO，37℃振蕩10min，使結晶充分溶解;待結晶充分溶解后置于酶標儀上，測量各孔的光密度值 D值:測量波長570nm，參考波長為630nm。計算不同藥物濃度的細胞存活度:細胞存活度(%) =實驗組OD平均值/對照組OD平均值×100%。檢測異博定對細胞存活率的影響。分析比較加異博定前后，異搏定對細胞存活率的影響。

表1 不同劑量對化療敏感性影響的組別設置

5.統計學方法:用SPSS13.0統計學軟件進行數據處理，以百分數(%)來表示。組間存活率的比較用χ2檢驗。

結果

用MTT法檢測異搏定聯合化療藥物對膠質瘤細胞U251化療敏感性。根據OD值計算細胞存活率，用細胞存活率及不同藥物濃度的對數值制作圖(表2)。

實驗結果表明，在體外，長春新堿低濃度區域，加入異搏定后，細胞存活率也有下降，但不明顯。隨著化療時間的增加，細胞存活度在各組中均有減少，但在長春新堿組減少的幅度最大，阿霉素組次之，而足葉乙苷組最少。異搏定聯合阿霉素組的濃度在0.3～60.0μg/ml，細胞存活度減少的幅度明顯大于其他濃度;異搏定聯合長春新堿組、異搏定聯合足葉乙甙組在0.5～200.0μg/ml這段濃度時，存活度明顯減少，以長春新堿組減少最為明顯。72h時間點，阿霉素組細胞存活率為35.72%，長春新堿組細胞存活率為16.37%，足葉乙苷組細胞存活率為61.72%，組間比較有統計學差異，P＜0.05(表3)。不同時間點，細胞存活率在各組中均有減少，但在長春新堿組減少的幅度最大，阿霉素組次之，而足葉乙甙組最少。

表2 各化療組不同藥物濃度時細胞存活率的比較

表3 各化療組不同時間點細胞存活率的比較

討論

體外化療藥物敏感試驗方法頗多，常用的有集落形成分析法、集落形成效率法、放射核素標記前體物抑制試驗，多細胞腫瘤球體形成試驗及MTT法，而MTT法已應用于各種腫瘤細胞系所代表的化療藥物的藥物敏感性的篩選。有報道體外MTT與患者自體內的敏感性具有高度相關性［2］。對于腦膠質瘤術后化療敏感性差的原因，除了化療藥物的血腦屏障通透性和多重耐藥基因的誘導表達所引起外，未能針對腫瘤類型及個體選擇敏感性藥物進行化療也是一個重要原因［3］。因此，針對膠質瘤對不同化療藥物的敏感性，為每個患者制定個體化的化療方案，避免無效化療，減少不必要的不良反應，提高化療效果十分必要［4］。

研究表明單一用藥療效差的原因是多方面的。聯合用藥時，尤其是異搏定聯合化療藥物對腫瘤細胞的打擊面增寬，可應付多種不同的腫瘤細胞，并且還減少了耐藥性的發生率。更為重要的是，異搏定聯合化療藥物的劑量強度超過單一用藥。對化療具有一定敏感性的腫瘤來說，有利于總療效的提高。國內有研究發現腦膠質瘤細胞化療敏感性與化療濃度及時間存在一定的關系，并且聯合化療的效果比單獨化療好［5］。于朝春等［6］根據化療藥物敏感性對腫瘤患者進行個體化化療，認為應用藥敏試驗指導化療有助于改善患者的生存狀態，降低復發率和病死率，提高生存率。張偉等［7］利用MTT法對69例人腦膠質瘤標本進行化療藥物敏感性測定，認為同一藥物及同一個體的膠質瘤標本對不同藥物的敏感性差異很大。我們通過異搏定分別聯合化療藥物(阿霉素、長春新堿、足葉乙甙)在不同作用時間點和不同劑量的作用下對膠質瘤化療敏感性的研究，結果發現，隨著聯合化療藥物劑量的增加，化療時間的延長，72h時間點，DOX組細胞存活率為34.57%，VCR組細胞存活率為13.44%，VP－16組細胞存活率為62.71%，長春新堿組對膠質瘤細胞U251的存活率影響最明顯。同時，有研究表明，沒有一種藥物能夠抑制所有腫瘤細胞系的生長［8，9］。我們的試驗也證實了這一點。DOX、VCR、VP－16等藥物為臨床抗膠質瘤化療常用藥，但只有VP－16具有較高的敏感率(約62.71%)，而其他兩種藥物的敏感性均較低。說明VP－16對膠質瘤細胞作用較好。

此外，本實驗還發現化療藥物作用時間與化療敏感性也存在著一定的聯系，但其內在機制尚不明確，需要進一步實驗加以證實。體外實驗結果與臨床療效相關性的資料表明，化療藥物體外敏感、體內敏感有效的符合率為50%～70%［6］。而體外藥物敏感性試驗，作為臨床病人臨床試驗的前期研究或敏感度的預測，并制定個性化化療方案具有重要價值［10］。

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4 Vanden BentMJ，HegiME，Stupp R.Recent developm entsin the use of chemotherapy in brain tumours［J］.Eur JCancer，2006，42(5): 582－588

5 祁紅，陳紅專，馮菊妹，等.地昔帕明單用和合用替尼泊苷對大鼠腦交織瘤C6細胞增殖的調控作用［J］.中國癌癥雜志，2000，10 (1):62－64

6 Nikkhah G，Tonn JC，Hoffmann O，etal.The MTT assay for chemosensitivity testing of human tumors of the central nervous system，partⅡ: evaluation of patient and drug－specific variable［J］.JNeuro Oncol，1992，13(1):13－24

7 張偉，江濤，袁芳，等.腦膠質瘤組織培養化療藥物敏感性的研究［J］.中國微侵襲神經外科雜志，2007，12(4):163－166

8 Rampling R，James A，Papanastassiou V.The present and future management ofmalignantbrain tumours:surgery，radiotherapy，chemotherapy［J］.JNeurol Neurosurg Psychiatry，2004，75 Suppl 2:1124－30

9 Grundy RG，Wilne SH，Robinson KJ.Primary postoperative chemotherapy without radiotherapy for treatment of brain tumours other than ependymoma in children under 3 years:results of the first UKCCSG/ SIOP CNS 9204 trial［J］.Eur JCancer，2010，46(1):120－133

10 Van den Bent MJ，Hegi ME，Stupp R.Recent developments in the use of chemotherapy in brain tumours［J］.Eur J Cancer，2006，42 (5):582－588