腦外傷大鼠周圍血中Th1/Th2比例變化及機制探討

屈曉東 荔志云 周 杰 王茂德

許多研究表明顱腦外傷(TBI)會導致機體免疫系統受損而使患者的發病率和病死率增加。顱腦外傷可引起免疫系統和大腦之間的平衡破壞，從而導致傷后免疫抑制和感染的發生。常見的感染如肺部感染、尿路感染和傷口感染，顱腦外傷本身作為一個獨立的危險因素，通過特定的機制，使患者對感染的易感性顯著增加。感染不僅使患者的預后不良，也增加了醫療成本和經濟負擔。所以減少腦外傷患者感染的發生，具有十分重要的意義。因此，探討顱腦外傷后免疫功能損害的機制可以幫助我們預防和治療感染并發癥，并為我們尋找新的治療靶點提供理論依據。

顱腦外傷后對人體的體液免疫和細胞免疫功能都有影響，而其對細胞免疫的功能影響更明顯。大量的研究表明，在顱腦外傷后體內的CD4+數量降低。CD4+T細胞有兩個主要亞群Th1(主要分泌IL－2和IFN－γ)和Th2(主要分泌IL－4和IL－5)，Th1和Th2的比例變化在許多疾病的不平衡發揮重要作用，如Th1/Th2降低與哮喘的發生有關，Th1/ Th2比例增加可導致流產的發生，而顱腦外傷后機體Th1/Th2比例如何變化尚未見有報道。那么顱腦外傷后機體的Th1/Th2細胞比例是否失衡?變化的相關機制是什么?這將是本文努力解決的問題。

材料與方法

1.腦外傷模型的建立:實驗動物選用成年SD大鼠(220～250g)，雌雄各半，均從西安交通大學醫學院動物實驗中心購買。將動物編號后應用隨機數字表，將腦外傷大鼠(TBI組)分為4個亞組，即致傷后1、3、5、10天，每組8只，每個時間點對照組大鼠6只。到相應時間點從心臟取血，取血后處死大鼠。大鼠腦損傷模型參照改進的Feeney氏自由落體硬膜外撞擊法，各對照組僅做右頂葉顱骨開窗，不致傷，其余操作同腦外傷組。整個造模操作過程嚴格無菌操作。對照組大鼠共24只，實驗組動物造模共42只，死亡2只，動物造模成功率95.2%。

2.儀器和檢測方法:FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司);試劑:免疫熒光單克隆抗體CD3/CD4/CD25+Foxp3(美國Biolegend公司);IL－4和IFN－γ抗體(eBioscience公司)。

3.大鼠周圍血中IFN－γ和IL－4的測定:從大鼠心臟采血2.5ml，室溫下血液自然凝固10～20min，然后2000r/min離心10min，仔細收集上清，取出血清在－20℃封存，待統一檢測，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。IL－4和IFN－γ水平用ELISA法(eBioscience)測量。IFN－γ檢測的最小濃度為31.3pg/m l(表1);IL－4檢測的最小濃度為1.6pg/ml(表2)。

4.大鼠外周血中CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞的流式細胞術測定:從大鼠心臟取血2ml，EDTA抗凝。采血后隨即往西安交通大學醫學院中心實驗室統一用流式細胞儀進行檢測。各試管中加入抗凝全血100μl，分別加入APC anti－rat CD4/PE anti－rat25和同型對照各20μl雙色標記單抗試劑，混勻后室溫避光20min，加固定液1ml靜置10min，2000r/min離心5min，棄上清，加打孔液1ml，2000r/min離心5min，棄上清，然后加Alexa Fluor488 anti－rat Foxp3 Flow Kit 5μl，混勻，放置20min，然后加1m l PBS液重懸細胞，上機檢測分析。各指標的測定按試劑盒說明書操作。數據處理使用處理軟件，由電腦自動處理得出結果(圖1、表3)。

表1 IFN－γ的濃度變化(pg/m l)

表2 IL－4的濃度變化(pg/m l)

圖1 流式細胞術測定CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞結果

表3 Treg細胞數量測定結果

結果

實驗大鼠生理參數，體重，神經檢查發現，對照組大鼠通常在麻醉后6h恢復意識，而腦外傷組大鼠傷后持續約12h昏迷，致傷24h后幾乎恢復正常飲食行為。腦外傷組大鼠左側肢體偏癱，爬行拖地，尾巴偏向左側。對照組和腦外傷組大鼠體重在造模前和造模后無顯著差異。

由表1可看出，顱腦外傷組大鼠外周血中IFN－γ濃度與對照組相比有明顯差異。IFN－γ濃度在傷后從第1天升高，第3天繼續升高，但與對照組相比這種差異無統計學意義(P＞0.05)。傷后第5天IFN－γ濃度繼續升高，并且顱腦外傷組與對照組有統計學意義(P＜0.05)，直至傷后第10天，這種差異仍顯著存在。

由表2可看出，顱腦外傷組大鼠外周血中IL－4濃度與對照組相比有明顯差異。IL－4濃度在傷后從第1天降低，第3天繼續降低，但與對照組相比這種差異無統計學意義(P＞0.05)。傷后第5天IL－4濃度繼續降低，并且顱腦外傷組與對照組有統計學意義(P＜0.05)，直至傷后第10天，這種差異仍顯著存在。

由表3可看出，顱腦外傷組大鼠外周血中Treg細胞數量從傷后第1天開始與對照組比較明顯下降，且有統計學差異(P＜0.05)，這種變化直至傷后第10天仍持續存在。而對顱腦外傷各亞組的Treg細胞數量進行分析發現，在各顱腦外傷亞組中Treg細胞數量無統計學差異。IFN－γ和IL－4之間的對比關系為，顱腦外傷后大鼠外周血中IFN－γ的濃度逐漸升高，而IL－4的濃度逐漸降低的變化趨勢。對IFN－γ和IL－4進行相關性分析，結果為IFN－γ和IL－4的變化呈明顯負相關(Pearson相關系數－0.443)。

討論

本研究中最重要的發現是，顱腦外傷可引起大鼠外周血中IFN－γ的濃度升高，IL－4的濃度和Treg下降。IFN－γ在腦外傷后第5天明顯升高(P＜0.05)，而IL－4從腦外傷后第5天明顯下降(P＜0.05)，這種下降趨勢持續到腦外傷后第10天仍然存在。Treg細胞從腦外傷后第1天開始下降(P＜0.05)，直至腦外傷后第10天仍未恢復正常。

一般認為輔助性CD4+T細胞分為兩類Th1和Th2［1～3］。通過對Th2細胞通路的激活模式主要引起白細胞介素增加，如IL－4、IL－5、IL－6、IL－10、IL－13，腫瘤壞死因子－α(TNF－α)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF);而Th1細胞則主要分泌IL－1、IL－2、IL－12、干擾素－γ(IFN－γ)，腫瘤壞死因子－β(TNF－β)和血小板聚集因子(PAF)，所以Th1主要分泌大量的INF－γ，Th2則主要分泌IL－4［4，5］。因此INF－γ是Th1的標志因子，有強大的免疫調節作用，IFN－γ能夠刺激巨噬細胞和提高細胞毒性T的活性，誘導一氧化氮的產生，增加MHC分子共刺激信號，刺激CD4+T細胞向Th1方向分化，而抑制CD4+T細胞向Th2方向分化［6］。在動物模型中和臨床治療中IFN－γ還有抗病毒作用［7］;IL－4是由Th2細胞分泌的一種重要的促炎因子，具有多種生物學效應，IL－4一直被認為是Th2分泌的代表因子［8～10］。因此我們通過測定大鼠外周血中 INF－γ和IL－4的濃度來代表Th1和Th2的量的多少。IL－4和INF－γ作用相互拮抗，從而保持了Th1細胞和Th2細胞之間的動態平衡，這種抗炎和促炎之間的失衡會導致很多疾病的發生，Th1/Th2的失衡取決于Th1/Th2細胞失衡通路的激活，這兩種途徑往往是相互排斥的，一個起保護作用，而另一個則促使疾病的發生［11，12］。IFN－γ的持續升高，IL－4的進行性下降表明顱腦外傷后大鼠外周血中Th1/Th2趨于Th1，而遠離Th2，這可能就是導致顱腦外傷后免疫抑制的一個原因。有研究表明IFN－γ的水平與顱腦外傷的嚴重程度呈正相關，所以IFN－γ的水平可以預測顱腦外傷的嚴重程度。

那么是什么原因導致顱腦外傷后血中Th1/Th2比例改變呢?Liesz A等［13］研究發現主要免疫調節因子CD4+CD25+Foxp3+調節性T淋巴細胞(Treg)是主要的腦保護調節因子，在缺血性腦損傷炎癥后針對多種炎癥通路進行調節。在Treg細胞缺失的小鼠腦梗死模型中，TNF－α、INF－γ和IL－1b的表達明顯升高［13］。Campbell等［14］都表明了Treg細胞通過Th細胞相關轉錄因子，以維持或恢復免疫反應過程中極化的Th1、Th2和Th17細胞，以恢復免疫平衡。因此我們檢測了顱腦外傷后大鼠外周血中的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的數量，研究結果發現顱腦外傷組中大鼠外周血中Treg細胞數量與對照組相比明顯減少，并且與Th1/Th2的比例呈明顯的負相關(相關系數－0.367且P＜0.05)。在一些研究中發現Treg數量減少或功能抑制可以導致一些自身免疫性疾病。因此，Treg細胞數量的減少可能是顱腦外傷后血中Th1/Th2比例失衡的原因。在本研究中我們沒有觀察到這些指標在顱腦外傷后多長時間才能夠恢復到正常水平，并且沒有將大鼠分為顱腦外傷輕、中、重組進行觀察。但這些問題將在我們后續研究中進一步解決。

總之，我們發現顱腦外傷可以引起大鼠外周血中IFN－γ水平明顯升高，IL－4表達下降，Th1/Th2失衡可能是導致顱腦外傷后機體容易發生感染的一個原因。而顱腦外傷后血中Treg細胞的減少可能是導致Th1/Th2比例失衡的一個原因。Allan，S.E.等聲稱Treg細胞是一個潛在的抗炎細胞，用Treg細胞來治療自身免疫性疾病，抑制移植排斥反應，促進癌癥和慢性感染的免疫反應等方面表現出了令人興奮的結果。James等研究表明通過基因治療增加IL－4的表達，用以預防和(或)治療大鼠關節液模型的關節炎、滑膜炎、降低促炎因子水平、血管化和骨退行性變等炎性改變，這提示對人類類似的治療可能也是有益的。因此提高顱腦外傷后機體血中的Treg細胞數量，或增加顱腦外傷后機體血中的IL－4水平，或減少顱腦外傷后機體血中的IFN－γ濃度可能能夠改善顱腦外傷患者的免疫狀況，預防和(或)治療顱腦外傷后的感染。因此Treg細胞在腦外傷后可能有潛在應用價值，提高IL－4水平或降低IFN－γ水平可能成為未來治療顱腦外傷的方法。然而在應用到臨床上的之前，仍有很多工作要做，但如果成功，可能會改變目前治療顱腦外傷的治療現狀。

重型顱腦損傷患者傷后存在明顯的Th1/Th2平衡偏移，如果我們從整體水平調節神經－內分泌－免疫網絡的平衡，如增加免疫促進類激素或減少免疫抑制類激素，用細胞因子調理及免疫營養調節治療等，就可以改善患者損傷后的Th1/Th2免疫失衡，增強患者機體抵抗力，降低患者繼發感染發生率，提高臨床治愈率。

1 Mosmann TR，Cherwinski H，Bond MW，et al.Two types ofmurine helper T cell clones.Definition according to profiles of lymphokine activities and secretory proteins［J］.The Journal of Immunol，1986，136 (7):2348－2357

2 Del Prete GF，De CarliM，Mastromauro C，etal.Purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis and excretory－secretory antigen(s)of Toxocara canis expand in vitro human T cells with stable and opposite(type 1T helper or type 2 Thelper)profile of cytokine production［J］.JClin Invest，1991，88(1):346－350

3 Umetsu DT，DeKruyff RH.TH1 and TH2 CD4+cells in human allergic diseases［J］.The Journal of Allergy Clinical Immunology，1997，100(1):1－6

4 Navarro－Zorraquino M，Garcl'a－Alvarez F，Mart'lnez－Fern'andez A R，et al.Pharmacological immunomodulation of surgical trauma［J］.Journal of Investigative Surgery，2007，20(5):283－289

5 Kimura M，Tsuruta S，Yoshida T.Unique profile of IL－4 and IFN－γ production by peripheral blood mononuclear cells in infantswith atopicdermatitis［J］.The Jouranl of Allergy and Clinical Immunology，1998，102(2):238－244

6 Jaffe HA，Gao ZC，Mori Y，et al.Selective inhibition of collagen gene expression in fibroblasts by an interferonγtransgene［J］.Experimental Lung Research，1999，25(3):199－215

7 Garg R，Gupta SK，Tripathi P，et al.Leishmania donovani:identification of stimulatory soluble anti－genic proteins using cured human and hamster lymphocytes for their rophylactic potential against visceral leishmaniasis［J］.Vaccine，2006，24(2):2900－2909

8 KopfM，Le GrosG，Bachmann M，etal.Disruption of themurine IL－4 gene blocks Th2 cytokine responses［J］.Nature，1993，362:245－248

9 Kuhn R，Rajewsky K，MullerW.Generation and analysisof interleukin－4 deficientmice［J］.Science，1991，254:707－710

10 Brusselle G，Kips J，JoosG，etal.Allergen induced airway inflammation and bronchial responsiveness in wildtype and interleukin－4－deficientmice［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，1995，12(4):254－259

11 Maher FO，Nolan Y，Lynch MA.Downregulation of IL－4－induced signalling in hippocampus contributes to deficits in LTP in the aged rat［J］.Neurobiology of Aging，2005，26(1):717－728

12 Cox F，Liew FY.T－cell subsets and cytokines in parasitic infections［J］.Immunology Today，1992，13:445－448

13 Liesz A，Suri－Payer E，Veltkamp C，et al.Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke［J］.naturemedcine，2009，15:192－199

14 Campbell DJ，Koch MA.Phenotypical and functional specialization of FOXP3+regulatory T cells［J］.Nature Reviews Immunology，2011， 11:119－130