外源性孕酮對(duì)去勢(shì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

胡志英 方馬榮 王 靜

孕酮治療月經(jīng)病已廣泛應(yīng)用于臨床，近年研究表明，其作用遠(yuǎn)超出生殖功能范疇，被稱為“活性神經(jīng)類固醇”。但有關(guān)它對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響，不同的研究結(jié)果不盡相同。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用行為認(rèn)知學(xué)檢測(cè)手段，對(duì)3月齡和5月齡健康雌性SD大鼠，卵巢切除去勢(shì)后皮下注射孕酮，采用Morris水迷宮測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化，探討外源性孕酮對(duì)去勢(shì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響，以期為臨床上醫(yī)源性卵巢去勢(shì)后的激素替代及某些疾病如早老性癡呆的治療探索新的治療線索并提供理論基礎(chǔ)。

資料與方法

1.動(dòng)物和分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為3月齡及5月齡，體質(zhì)量為250±20g的健康雌性SD大鼠各60只［浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SYXK(浙)2007－0099］。每年齡組隨機(jī)為6組:①正常組;②卵切組;③卵切+孕酮組;④卵切+芝麻油組;⑤假手術(shù)+孕酮組;⑥假手術(shù)+芝麻油組。

2.方法:(1)分組給藥:正常組:不做任何處理;卵切組:切除卵巢，不給予任何治療;卵切+孕酮組:切除卵巢，皮下注射孕酮20mg/kg進(jìn)行治療;卵切+芝麻油組:切除卵巢，皮下注射等體積的無(wú)菌芝麻油進(jìn)行治療;假手術(shù)+孕酮組:打開(kāi)腹腔，不切除卵巢，但是給予皮下注射孕酮20mg/kg進(jìn)行治療;假手術(shù)+芝麻油組:打開(kāi)腹腔，不切除卵巢，給予皮下注射等體積的無(wú)菌芝麻油進(jìn)行治療。以后每7天給藥1次，共4次。(2)Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè):給藥3周后，參照Morris水迷宮，對(duì)大鼠進(jìn)行空間記憶的訓(xùn)練和測(cè)試［1］。水迷宮為直徑130cm，高50cm的圓形水池，水深30cm，水溫保持在20± 1℃左右，平臺(tái)為透明有機(jī)玻璃，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中周圍環(huán)境條件保持安靜、穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練期和測(cè)試期。第1天進(jìn)行訓(xùn)練，將大鼠沿壁輕放入水中，記錄大鼠的逃避潛伏期:即從大鼠入水到找到水下平臺(tái)所需要的時(shí)間，若大鼠120s內(nèi)未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)大鼠找到平臺(tái)，逃避潛伏期以120s計(jì)。大鼠找到平臺(tái)或被引導(dǎo)到平臺(tái)上后停留10s。然后擦干放回籠內(nèi)。第2天開(kāi)始直到第5天進(jìn)行實(shí)際的行為學(xué)測(cè)驗(yàn)，以找到平臺(tái)所需的時(shí)間的平均值(平均潛伏期)和找到平臺(tái)的次數(shù)(平臺(tái)次數(shù))來(lái)表示。

結(jié)果

1.3月齡青年期大鼠:潛伏期是指在規(guī)定的2min內(nèi)，需要多長(zhǎng)時(shí)間能夠找到平臺(tái)。與正常組比較，3月齡青年期大鼠卵巢切除去勢(shì)后平均潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01);與卵切組及卵切+芝麻油組比較，卵切+孕酮組、假手術(shù)+孕酮組及假手術(shù)+芝麻油組逃避學(xué)習(xí)成績(jī)明顯提高(P＜0.01);假手術(shù)+孕酮組與正常組及假手術(shù)+芝麻油組比較學(xué)習(xí)成績(jī)無(wú)顯著差異(P＞0.05，表1、圖1)。

表1 3月齡青年期大鼠平均潛伏期

圖1 3月齡青年期大鼠不同組別平均潛伏期比較

2.平臺(tái)次數(shù):平臺(tái)次數(shù)是指在規(guī)定的2min內(nèi)找到平臺(tái)的次數(shù)。與正常組比較，3月齡青年期大鼠卵巢切除去勢(shì)后平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.01);與卵切組比較卵切+孕酮組、假手術(shù)+孕酮組及假手術(shù)+芝麻油組空間記憶能力稍有改善(P＜0.05);假手術(shù)+孕酮組與正常組及假手術(shù)+芝麻油組比較學(xué)習(xí)成績(jī)無(wú)顯著差異(P＞0.05，表2、圖2)。

表2 3月齡青年期大鼠平臺(tái)次數(shù)

圖2 3月齡青年期大鼠不同組別平臺(tái)次數(shù)比較

3.5 月齡成年期大鼠:(1)平均潛伏期:與正常組比較，5月齡成年期大鼠卵巢切除去勢(shì)后平均潛伏期延長(zhǎng)(P＜0.05);假手術(shù)+孕酮組學(xué)習(xí)成績(jī)明顯優(yōu)于卵切組及卵切+芝麻油組(P＜0.01);與卵切組及卵切+芝麻油組比較卵切+孕酮組學(xué)習(xí)成績(jī)無(wú)顯著差異(P＞0.05);假手術(shù)+孕酮組與正常組及假手術(shù)+芝麻油組比較學(xué)習(xí)成績(jī)亦無(wú)顯著差異(P＞0.05，表3、圖3)。(2)平臺(tái)次數(shù):與正常組比較，5月齡成年期大鼠卵巢切除去勢(shì)后平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.01);假手術(shù)+孕酮組學(xué)習(xí)成績(jī)優(yōu)于卵切組(P＜0.05，表4、圖4)。

表3 5月齡成年期大鼠平均潛伏期

圖3 5月齡成年期大鼠不同組別平均潛伏期比較

表4 5月齡成年期大鼠平臺(tái)次數(shù)

圖4 5月齡成年期大鼠不同組別平臺(tái)次數(shù)比較

討論

Morris水迷宮(Morriswatermaze，MWM)是英國(guó)心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)的用于研究大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的裝置［2］，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的常用工具，在世界上已經(jīng)得到廣泛地認(rèn)可，是醫(yī)學(xué)院校開(kāi)展行為學(xué)研究尤其是學(xué)習(xí)與記憶研究的首選經(jīng)典實(shí)驗(yàn)［3］。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是，嚙齒類動(dòng)物在水中有強(qiáng)烈的逃避水環(huán)境的動(dòng)機(jī)，并以最快、最直接的途徑逃離水環(huán)境。學(xué)會(huì)逃避水環(huán)境的過(guò)程體現(xiàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力;根據(jù)周圍環(huán)境進(jìn)行空間定位，有目的地游往水中安全的地方(平臺(tái))，體現(xiàn)動(dòng)物的空間記憶能力。

經(jīng)典的水迷宮試驗(yàn)分為空間定向航行(place navigation)試驗(yàn)和空間搜索(spatial probe)試驗(yàn)兩部分，其中定向航行試驗(yàn)用于測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)的能力，以動(dòng)物潛伏期時(shí)間的長(zhǎng)短衡量其學(xué)習(xí)能力，潛伏期愈短其學(xué)習(xí)能力愈強(qiáng);而空間搜索試驗(yàn)用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的能力，以動(dòng)物站臺(tái)區(qū)域停留時(shí)間和穿越站臺(tái)區(qū)域次數(shù)評(píng)價(jià)其空間記憶能力，動(dòng)物穿越站臺(tái)區(qū)域次數(shù)愈多則表明其空間記憶能力愈強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)以Morris水迷宮試驗(yàn)作為動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試手段，為排除手術(shù)及皮下注射的干擾，將卵切+孕酮組(即切除卵巢，皮下注射孕酮進(jìn)行治療)作為實(shí)驗(yàn)觀察組，將正常組(即不做任何處理)、卵切組(即切除卵巢，不給予任何治療)、卵切+芝麻油組(即切除卵巢，皮下注射等體積的無(wú)菌芝麻油)及假手術(shù)+孕酮組(即打開(kāi)腹腔，不切除卵巢，但給予皮下注射孕酮進(jìn)行治療)和假手術(shù)+芝麻油組(即打開(kāi)腹腔，不切除卵巢，皮下注射等體積的無(wú)菌芝麻油)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，觀察研究外源性孕酮對(duì)去勢(shì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卵巢切除去勢(shì)對(duì)3月齡青年期和5月齡成年期SD大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力均是有害的，表現(xiàn)為尋找隱匿平臺(tái)的平均潛伏期延長(zhǎng)，穿過(guò)平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)減少，提示大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降可能與卵巢切除去勢(shì)后雌、孕激素的缺乏有關(guān)。

學(xué)習(xí)記憶與海馬神經(jīng)元突觸可塑性密切相關(guān)，而生殖內(nèi)分泌的狀態(tài)、卵巢缺失以及出現(xiàn)早老性癡呆(AD)相關(guān)的病理學(xué)變化都會(huì)調(diào)整卵巢類固醇激素引起的神經(jīng)可塑性。已證實(shí)圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女應(yīng)用激素替代治療(HRT)能改善圍絕經(jīng)期癥狀，在詞匯記憶、警覺(jué)和推理等方面均有改善，可能減少或延遲AD的發(fā)生。婦女在絕經(jīng)期激素喪失會(huì)使認(rèn)知能力退化，使女性的AD患病率明顯高于男性，有研究提示HRT能通過(guò)減少癡呆發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)抵消這種AD發(fā)病率的性別差異，改善腦部功能退化，延緩或預(yù)防AD的發(fā)生［4～6］。而近年美國(guó)一項(xiàng)大規(guī)模的臨床前瞻性研究報(bào)道了令學(xué)者們困惑的結(jié)果:雌孕激素聯(lián)合治療可能會(huì)增加?jì)D女患AD的風(fēng)險(xiǎn)［7］。雌孕激素聯(lián)合治療對(duì)AD患者認(rèn)知能力可能是有損害的，而單用雌激素治療有益于認(rèn)知能力［8～10］。故目前有人主張對(duì)女性絕經(jīng)后應(yīng)補(bǔ)充小劑量雌激素，認(rèn)為可以減少腦卒中和老年癡呆的發(fā)病率，對(duì)是否同時(shí)應(yīng)用孕激素，目前尚有爭(zhēng)議［7，11，12］。

孕酮對(duì)女性的生理和病理生理影響已有很多的研究及實(shí)際的臨床應(yīng)用，但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用直至近年方引起關(guān)注。近年的研究表明，孕酮的作用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出生殖功能的范疇，它不僅可在神經(jīng)系統(tǒng)中合成分泌，并且能影響神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的信號(hào)分子。在類固醇激素家族中，孕酮作為一種可以在神經(jīng)系統(tǒng)合成并發(fā)揮作用的神經(jīng)活性甾體，其作用機(jī)制正逐漸被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所研究。盡管孕酮作用機(jī)制尚不很清楚，但對(duì)這一傳統(tǒng)類固醇激素有了新的認(rèn)識(shí)，而最近不斷的一些新發(fā)現(xiàn)也逐漸引起人們對(duì)其在臨床應(yīng)用上的一些新思索［13］。近年來(lái)，孕酮對(duì)腦、脊髓和周圍神經(jīng)的保護(hù)及損傷后修復(fù)等研究引起了人們極大的興趣。研究發(fā)現(xiàn)孕酮在多種腦損傷動(dòng)物模型的治療中具有神經(jīng)保護(hù)作用，能改善模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，減輕腦水腫、延緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、防止神經(jīng)元的減少和促進(jìn)神經(jīng)髓鞘的合成［7，14，15］。有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦損傷前或后的一段時(shí)間，發(fā)現(xiàn)給予動(dòng)物外源性孕酮治療，能減輕損傷所致的組織學(xué)和行為學(xué)的損害。盡管眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)了孕酮對(duì)缺血再灌注損傷腦的保護(hù)作用，但也有不一致的結(jié)果，如Murphy等的結(jié)果顯示孕酮加重去卵巢大鼠局灶性腦缺血后紋狀體的損傷程度，而外源性孕酮對(duì)去勢(shì)造成絕經(jīng)大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力的影響，對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善有利抑或有害尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，我們將3月齡和5月齡SD大鼠卵巢切除去勢(shì)后皮下注射孕酮，采用Morris水迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)，觀察孕酮對(duì)大鼠行為認(rèn)知能力的影響，實(shí)驗(yàn)觀察到外源性孕酮能改善青年期去勢(shì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，使逃避學(xué)習(xí)成績(jī)明顯提高，平臺(tái)次數(shù)稍有增加，但不能提高成年期去勢(shì)大鼠的認(rèn)知能力，提示外源性孕酮對(duì)去勢(shì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善與年齡有關(guān)，與Singh等報(bào)道一致，可能與孕酮可減少與年齡相關(guān)的神經(jīng)易損性的毒性損傷有關(guān)［7，14］。Anderson等研究發(fā)現(xiàn)不同劑量孕酮對(duì)DNA損傷應(yīng)答、細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控、先天的免疫應(yīng)答及血管的重塑等均有不同的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中外源性孕酮不能提高成年期去勢(shì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，是否還與成年期大鼠生殖內(nèi)分泌的狀態(tài)有關(guān):即體內(nèi)已含有一定量的雌孕激素，這樣要達(dá)到孕酮保護(hù)作用的閾值比較高，而使得孕酮的應(yīng)用未達(dá)到適當(dāng)?shù)闹委熁虮Ｗo(hù)劑量有關(guān)?

總之，孕酮在許多方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，且目前國(guó)內(nèi)外已有不少有關(guān)臨床應(yīng)用治療各種神經(jīng)損傷的報(bào)道。本研究為孕酮安全用于激素替代，并可作為一種臨床治療醫(yī)源性的卵巢去勢(shì)引起的學(xué)習(xí)記憶能力的下降，以及有可能用于某些疾病如早老性癡呆的治療探索新的治療線索并提供一定理論基礎(chǔ)。但仍存在一些問(wèn)題需進(jìn)一步解決，如因經(jīng)費(fèi)問(wèn)題未同時(shí)觀察外源性孕酮對(duì)老年期去勢(shì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響、治療不同劑量和治療時(shí)間窗的選擇以及孕酮發(fā)揮作用的途徑等方面尚需在以后的研究中進(jìn)一步探討。

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