真核肽鏈釋放因子eRF3b在人肝組織及體外肝細胞中的表達

李 曼，賈 媛，員美娜，劉志鵬，劉殿武

（河北醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室，河北石家莊 050017）

·研究快報·

真核肽鏈釋放因子eRF3b在人肝組織及體外肝細胞中的表達

李 曼，賈 媛，員美娜，劉志鵬，劉殿武*

（河北醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室，河北石家莊 050017）

肝細胞；真核細胞；細胞培養技術

在真核細胞中，真核釋放因子eRF3有許多功能，它控制調節細胞周期由G1期到S期的轉相［1］，在翻譯終止過程中以GTP依賴的形式調節蛋白的合成［2］等，本室前期利用飛行質譜檢測到乙型肝炎病毒相關肝病中存在著差異蛋白真核肽鏈釋放因子3b（eukaryotic peptide chain release-factor GTP-bind subunit，eRF3b），本研究對其在不同組織細胞中的表達進行分析，旨在為其作用機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 組織來源：河北醫科大學第四醫院外科手術切除的肝癌4例，并取癌旁組織4例作為對照。石蠟包埋后切片，進行HE染色和免疫組織化學染色；細胞來源，QSG-7701（正常人肝細胞），HepG2（人肝癌細胞），HepG2.215（乙型肝炎病毒感染的人肝癌細胞），10%胎牛血清培養，進行免疫組織化學染色。

1.2 Real time RT-PCR：引物由NCBI-Primer 3.0設計，上海生工生物工程公司合成。應用Quant One Step qRT-PCR（SYBR Green 1）Kit于20μL體系內進行擴增，儀器為Rotor-GeneTM6000。循環條件為，50℃反轉錄30 min，95℃預變性2 min，94℃變性20s，68℃延伸20s，共40個循環。

1.3 Wstern Blot：細胞總蛋白上樣量60μg，20mA恒流2h；切膠后進行干轉移1.5h；經過封閉，一抗、二抗孵育及洗脫后，遠紅外成像：奧德賽雙色遠紅外成像系統700 nm通道進行掃膜并保存圖像。

1.4 統計學方法：應用SAS 9.3統計軟件分析，計量資料以±s表示，多組均數的比較采用ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學檢測eRF3b蛋白的表達：4對肝組織標本（癌和癌旁組織）HE染色結果顯示癌旁組織可見細胞核圓，細胞排列整齊。腫瘤細胞排列凌亂，增生活躍，呈多邊形，核大，核漿比例增大，核分裂相易見。免疫組織化學結果顯示，在4對組織中，eRF3b的表達在癌旁組織有2個為（ +），2個為（-），在癌組織中，1個表達（ ++），有2個為（+），1個為（-）。eRF3b/GSPT2蛋白在QSG-7701、HepG2以及HepG2.215內也是陽性表達。

2.2 不同細胞系基因水平表達差異：△△Ct相對定量結果顯示GSPT2在各細胞株的表達有所差異，在 HepG2細胞中表達量高于正常細胞以及HepG2.215細胞，而ERF1以及GSPT1在HepG2. 215中表達量明顯高于其他2種細胞株。

2.3 不同細胞系 eRF3b蛋白水平表達情況：Western Blot檢測可見 eRF3b蛋白特異性條帶，eRF3b/α-tublin的比值，肝癌細胞珠HepG2的相對表達量0.73，QSG-7701和HepG2.215細胞株分別為0.25及0.24。

3 討 論

本室前期對乙型肝炎病毒相關疾病患者血清進行質譜檢測，發現相對分子質量4 210的差異性蛋白片段，在慢性乙型肝炎血清和肝癌血清中差異顯著，后經二級質譜鑒定屬于真核肽鏈釋放因子3b，即eRF3b，所以研究設想eRF3b是否和肝癌之間存在著某些聯系。基于此，本研究首先對eRF3b在肝組織的表達進行了免疫組織化學分析，因為只是定性分析eRF3b是否在肝組織表達，研究中僅用了4對肝癌及癌旁組織，結果顯示eRF3b在肝組織為陽性表達。本研究接下來用Western Blot對eRF3b在不同類型肝細胞的表達情況進行測定，結果可見特異性條帶，相對分子質量位于60 000與94 000之間，大約為83 000，與預期的相對分子質量68 883有所差別，但與文獻報道一致［3］。本研究還進一步分析了不同肝源細胞系中eRF3b在mRNA水平及蛋白水平的表達，發現eRF3b在HepG2的表達量高于QSG-7701以及HepG2.215，真核肽鏈釋放因子eRF1以及 eRF3a/GSPT1在HepG2.215表達量最高，在不同類型細胞中出現的表達量差異的原因有待進一步研究。

［1］ ZHOURAVLEVA G，FROLOVA L，LE GOFF X，et al.Termination of translation in eukaryotes in governed bytwointeracting polypeptide chain release factors，eRF1 and eRF3［J］.EMBO J，1995，14（16）：4065-4072.

［2］ OZAWA K，MURAKAMI Y，EKI T，et al.Mapping of the human GSPT1 gene，a human homolog of the yeast GST1 gene，to chromosomal band 16p13.1［J］.Somat Cell Mol Genet，1992，18（2）：189-194.

［3］ JAKOBSEN CG，SEGAARDTM，JEAN-JEMND，etal. Identification of eRF3b，a human polypeptide chain release factor with eRF3 activity in vitro and in vivo［J］.Molecular Biology，2001，35（4）：575-583.

（本文編輯：劉斯靜）

R575.1

B

1007-3205（2012）09-1091-02

2012-06-27；

2012-08-01

國家自然科學基金（30972516）；河北省自然科學基金（C2010000481）；河北省衛生廳重大科技攻關項目（20090004）

李曼（1977-），女，河北保定人，河北醫科大學公共衛生學院講師，醫學博士，從事肝病分子流行病研究。

*通訊作者。E-mail：liudw56@tom.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.041