rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞移植治療糖尿病下肢血管病變的臨床觀察

周亞茹，李春芝，欒 峰，孟建波，胡曉東，王戰(zhàn)建*

（1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院耳鼻喉科，河北石家莊 050051；3.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院血液科，河北石家莊 050051；4.河北省健海生物芯片技術有限責任公司，河北石家莊050035）

rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞移植治療糖尿病下肢血管病變的臨床觀察

周亞茹1，李春芝1，欒 峰2，孟建波3，胡曉東4，王戰(zhàn)建1*

（1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院耳鼻喉科，河北石家莊 050051；3.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院血液科，河北石家莊 050051；4.河北省健海生物芯片技術有限責任公司，河北石家莊050035）

目的探討重組人粒細胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhGCSF）動員后聯(lián)合骨髓干細胞移植治療糖尿病下肢血管病變的有效性和安全性。方法選擇30例糖尿病下肢血管病變患者，采用rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞對患肢進行治療，以治療前作為自身對照；治療后1～6個月觀察患者肢體膚色、皮溫、肢體麻木疼痛、間歇性跛行、踝肱指數(shù)（ankle brachial index，ABI）及經(jīng)皮氧分壓（transcutaneous pressure of oxygen，TcPO2）的變化。結(jié)果治療后患者肢體皮膚顏色、皮溫、肢體麻木疼痛癥狀、間歇性跛行及ABI、TcPO2均較治療前明顯改善，且無相關并發(fā)癥和不良反應發(fā)生。結(jié)論rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞移植可有效治療糖尿病下肢血管病變，此治療方法安全、有效，能提高患者的生活質(zhì)量。

糖尿病；干細胞移植；粒細胞集落刺激因子

KEY WORDS：diabetic mellitus；stem cells transplantation；granulocyte clony-stimulating factor

近年來糖尿病患病率呈明顯上升趨勢，中國已成為全球糖尿病患病例數(shù)最多的國家。糖尿病的最大危害是其慢性并發(fā)癥，可累及全身多個器官系統(tǒng)，其中下肢血管病變（lower limb vascular disease，LVD）是最嚴重的并發(fā)癥之一，典型癥狀包括間歇性跛行、靜息痛、皮膚潰瘍和壞疽，是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。LVD患者常有動脈遠端血管閉塞或狹窄，血液循環(huán)差，內(nèi)科常規(guī)的抗凝、調(diào)脂、擴血管等藥物治療效果不明顯。此外，LVD屬多節(jié)段血管病變，多數(shù)患者無法進行介入治療或血管搭橋手術。因此，通過干細胞移植等手段，提高血管再生能力，促進側(cè)支循環(huán)的形成，成為治療LVD的新手段。本研究旨在探討rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞移植治療糖尿病LVD的有效性和安全性。

1 資料與方法

1.1 研究對象：2009年1月—2010年12月在河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院內(nèi)分泌科和石家莊市腎病醫(yī)院干細胞研究中心就診的糖尿病伴有LVD患者30例［有足部和（或）下肢發(fā)涼、麻木、疼痛，間歇性跛行，足部潰瘍等癥狀］。均排除糖尿病視網(wǎng)膜出血性病變，嚴重心、肝、腎、肺功能不全或一般狀況很差不能耐受干細胞移植術者。其中男性20例，女性10例，年齡35～72歲，平均（55±8）歲，病程4～27年，平均病程（11±3）年。均有肢體冷感、疼痛癥狀，25例患者有肢體麻木癥狀，14例患者有足部潰瘍。所有患者均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)學倫理委員會論證通過。

1.2 方法：采用治療前后自身對照研究，評價指標及標準如下。①足部潰瘍的分級（Wagner分級法），0級，有發(fā)生足潰瘍的危險因素，目前皮膚無開放性病灶；1級，表面有潰瘍，臨床上無感染；2級，較深的潰瘍感染病灶，常合并軟組織炎，無膿腫或骨的感染；3級，深度感染，伴有骨組織病變或膿腫；4級，骨質(zhì)缺損，部分趾、足壞疽；5級，足的大部或全部壞疽。②踝肱指數(shù)（ankle-brachial index，ABI），采用彩色雙功能超聲診斷儀測定ABI，正常值0.9～1.3，ABI＜0.9表示下肢血管存在不同程度的狹窄（缺血），ABI＞1.3表示動脈硬化。③經(jīng)皮氧分壓（transcutaneous oxygen pressure，TcPO2），采用經(jīng)皮氧分壓檢測儀測定足背TcPO2，TcPO2測定能較好地反映足踝以下部位皮膚的微循環(huán)狀態(tài)，從而反映周圍動脈灌注情況。

1.3 治療過程：①干細胞治療前，使患者空腹血糖

控制在 8mmol/L以下，餐后 2h血糖控制在10mmol/L以內(nèi)。②重組人粒細胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF）動員后聯(lián)合自體骨髓干細胞移植，術前 1～4d皮下注射粒細胞集落刺激因子300μg/d，第5天在硬膜外麻醉下取患者髂骨骨髓血300mL，經(jīng)沉淀、離心、分離后制備40mL骨髓干細胞懸濁液，計數(shù)細胞總量及CD34+細胞含量。在硬膜外麻醉下，沿腓腸肌局部缺血部位多點肌內(nèi)注射骨髓干細胞懸濁液［0.1mL（5×106個骨髓單個核細胞）/點］，各點間距2cm×2cm。③其他治療，在干細胞移植治療的同時給予降糖、調(diào)脂、降壓、擴血管以及足部潰瘍定期清創(chuàng)換藥治療。

1.4 統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 主觀評價指標：干細胞移植術后1個月患肢疼痛的改善率達90%（27/30），患肢冷感的改善率為100%（30/30），肢體麻木改善率達92%（23/ 25），足部潰瘍的好轉(zhuǎn)率為71.4%（10/14）。其中肢體冷涼的癥狀緩解最快，在術后3～4d即有緩解；肢體麻木及疼痛感在術后1周開始緩解，1個月后達到穩(wěn)定狀態(tài)。6例1級足部潰瘍完全愈合，3例2級潰瘍中2例轉(zhuǎn)為1級，5例4級潰瘍中2例潰瘍范圍縮小，3例癥狀無緩解（糖尿病病史較長，血糖控制較差，有多年吸煙史）。

2.2 客觀評價指標：①間歇性跛行，30例患者中有18例存在間歇性跛行，經(jīng)干細胞移植治療后，其中10例患者正常步速下行走500m以上無肢體疼痛癥狀出現(xiàn)，3例患者步行距離較術前增加100m以上，但未達到500m，總有效率為72.2%。②ABI，干細胞移植后6個月，患者下肢ABI由術前的0.45± 0.11增加到術后的0.69±0.13，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.719，P＜0.01）。③TcPO2，干細胞移植術后6個月，與治療前相比，患者足背 TcPO2由術前的（18±2）mmHg增加到術后的（25±2）mmHg，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.555，P＜0.01）。

2.3 相關并發(fā)癥和不良反應：干細胞移植過程中，患者無不適癥狀。移植術后24h可見受試肢體輕度腫脹，患者有脹感，1周后腫脹消失。整個治療過程中，患者均未出現(xiàn)異常癥狀及體征，其血細胞分析、凝血酶原時間和肝、腎功能無特殊改變。

3 討 論

目前，內(nèi)科手段治療糖尿病下肢血管病變療效有限。干細胞是一類具有自我復制和更新能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，可用于治療如血液病、下肢缺血性疾病［1-2］等多種病變。自體干細胞植入缺血的肢體，可促進局部血管的形成，取得明顯療效，國內(nèi)外已有不少報道［3-4］。本課題組前期動物實驗研究結(jié)果顯示，rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞局部注射移植可治療糖尿病下肢缺血性疾病，其效果明顯優(yōu)于單純用rhG-CSF治療和單純骨髓干細胞移植治療。此方法療效好可能歸于以下幾點：①骨髓中存在許多種類的成體干細胞，對于外周血源的單個核細胞來說，骨髓源的單個核細胞群中含有更多的有利于血管新生的細胞亞群。②經(jīng)動員刺激的骨髓內(nèi)存在大量更原始的干細胞和（或）血管內(nèi)皮祖細胞，這些細胞的分化能力更強，更利于細胞的融合和血管的新生。③經(jīng)動員刺激可使附壁的骨髓間充質(zhì)細胞的貼壁能力下降，經(jīng)過帶側(cè)孔的骨髓穿刺針的用力抽吸，可使更多的骨髓間充質(zhì)細胞被抽出，同時也可得到一部分細胞生長因子，有利于創(chuàng)造一個細胞生長所需要的基質(zhì)環(huán)境［5］。④局部注射可使干細胞直接到達患處，避免了經(jīng)外周血注射帶來的對干細胞高血糖毒性和歸巢效率不高的弊端。基于此研究基礎，我們進一步探討了rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞移植治療糖尿病LVD患者的有效性和安全性，我們將分離純化的干細胞在下肢缺血部位多點肌內(nèi)注射，無需特殊麻醉，結(jié)果顯示患者術中無特殊不適，與以往的研究相一致［6］。

已有研究［7］證實在治療過程中應先將壞疽及潰瘍清瘡，切口較為新鮮后再行干細胞移植可加速痊愈，如已出現(xiàn)壞疽，截肢將不可避免。因此，患者在疾病早期進行干細胞移植對于保留肢體是非常有意義的。我們共治療了30例糖尿病伴LVD的患者，結(jié)果顯示，治療后患者肢體皮膚顏色、皮溫、肢體麻木和（或）疼痛癥狀、間歇性跛行、ABI及TcPO2均較治療前明顯改善。治療療效欠佳的均為病程長（＞20年）的老年糖尿病患者，上述患者平時血糖控制不佳，均有20年以上的吸煙史，血管條件相對較差。本課題組前期動物實驗研究結(jié)果顯示高血糖是影響骨髓干細胞移植促血管新生效果的重要因素。因此，采用干細胞治療糖尿病下肢血管病變，宜選擇病變早期并且血糖控制好的病例進行，可得到滿意療效。

下肢皮膚微循環(huán)功能障礙導致皮膚供氧減少是糖尿病LVD的重要危險因素，在微循環(huán)的檢查應用于糖尿病下肢缺血性疾病的篩查研究中，TcPO2的檢測日益引起人們的注意［8］。有研究對TcPO2在評價微循環(huán)障礙的準確性上與ABI檢測做了對比，結(jié)果符合率為93.9%，敏感度90.2%，特異度約95.2%［9］。現(xiàn)在普遍認為 20mmHg≤TcPO2＜40mmHg為動脈灌注輕度受損，其中TcPO2＞30mmHg切口愈合可能性大。可見，TcPO2的測定可作為診斷下肢動脈硬化閉塞、早期發(fā)現(xiàn)糖尿病足潰瘍的風險指標。本研究結(jié)果顯示，干細胞移植術后6個月，與治療前相比，患者足背TcPO2由術前的（18±2）mmHg增加到術后的（25±2）mmHg，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

綜上所述，rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞局部注射移植治療，可有效緩解患者肢體皮膚顏色、皮溫、肢體麻木疼痛癥狀，患者間歇性跛行及 ABI、TcPO2均較治療前明顯改善。因此，rhG-CSF動員后聯(lián)合骨髓干細胞移植可有效治療糖尿病LVD，此治療方法安全、有效，能提高患者的生活質(zhì)量。

［1］HAMANO K，LI TS，KOBAYASHI T，et al.The induction of angiogenesis by the implantation of autologous bone marrow cell：a novel and simple therapeutic method［J］.Surgery，2001，130（1）：44-54.

［2］HASEBE H，OSADA M，KODAMA Y，etal.Therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow cells in a patient with progressive limb ischemia due to arteriosclerosis obliterans：a case report［J］.J Cardiol，2004，43（4）：179-183.

［3］TATEISHI-YUYAM AE，MATSUBARA H，MUROHARA T，et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-m arrow cells：a pilot study and a cont rolled trial［J］.Lancet，2002，360（9331）：427-435.

［4］楊曉鳳，吳雁翔，王紅梅，等.自體外周血干細胞移植治療62例缺血性下肢血管病的臨床研究［J］.中華內(nèi)科雜志，2005，44（2）：95-98.

［5］谷涌泉，張健，齊立行，等.骨髓動員刺激后自體骨髓源單個核細胞移植治療下肢缺血的初步臨床研究［J］.中國修復重建外科雜志，2006，20（10）：1017-1020.

［6］張瑞清，鄭憲玲，崔鳳琴，等.自體骨髓干細胞移植治療糖尿病足16例療效觀察［J］.臨床薈萃，2009，24（16）：1432-1433.

［7］王廣宇，朱旅云，馬利成，等.自體干細胞移植治療重癥糖尿病足15例［J］.臨床薈萃，2008，23（1）：45-46.

［8］PROCHAzKA V，GUMULEC J，CHMELOV áJ，et al.Autologous bone marrow stem cell transplantation in patients with end-stage chronical critical limb ischemia and diabetic foot［J］.Vnitr Lek，2009，55（3）：173-178

［9］李夢娟，李素梅，汝燕，等.經(jīng)皮氧分壓聯(lián)合踝臂指數(shù)在2型糖尿病合并下肢動脈病變中的臨床應用［J］.國際病理科學與臨床雜志，2011，31（5）：381-384.

（本文編輯：劉斯靜）

BONE MARROW STEM CELL TRANSPLANTATION COMBINED WITH rhG-CSF IN TREATING DIABETIC LOWER LIMB VASCULAR DISEASE

zHOU Yaru1，LI Chunzhi1，LUAN Feng2，MENG Jianbo3，HU Xiaodong4，WANG zhanjian1*
（1Department of Endocrinology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China；2.Department of Ophthalmology and otorhinolaryngology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China；3.Department of Hematology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China；4.Gene-Health Biochip Techology Company Limited，Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China）

ObjectiveTo evaluate the effect and safety of bone marrow stem cell transplantation combined with hypodermic injection of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor（rhGCSF）in treating diabetic lower limb ischemia.MethodsThirty patients with diabetic lower limb ischemia diseases were enrolled in this study.The patients received rhG-CSF and bone marrow stem cell transplantation by intramuscular injections at multiple sites of affected limb.During 1～6 months of follow-up，skin color，skin temperature，sensation，claudication，ankle brachial index（ABI），and transcutaneous pressure of oxygen（TcPO2）were observed and compared with pre-treatment.ResultsThe symptoms were greatly relieved 1 month after treatment.The ABI and TcPO2 were increased from 0.45±0.11 to 0.69±0.13 and 18±2 to 25±2（P＜0.01）6 months after stem cell transplantation treatment，respectively.ConclusionrhG-CSF combined with bone marrow stem cell transplantation is an effective and feasible method for the treatment of diabetic lower limb ischemia disease.

R587.1

A

1007-3205（2012）11-1245-03

2012-04-24；

2012-06-17

河北省科技廳重大疾病及創(chuàng)新藥物專項基金資助項目（06276106D）

周亞茹（1972-），女，河北唐山人，河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事內(nèi)分泌疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：hbsywzj@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.11.002