致病疫霉拮抗真菌研究進展

蔣繼志，郭俊亭，李麗艷

(河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002)

學科綜述

致病疫霉拮抗真菌研究進展

蔣繼志，郭俊亭，李麗艷

(河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002)

致病疫霉主要引起馬鈴薯和番茄的晚疫病，是嚴重制約馬鈴薯和番茄生產可持續發展的首要因素.生產中可利用的措施主要有選育和利用抗病品種、農業栽培措施和化學農藥，但因病菌生理分化明顯、遺傳變異迅速，現有措施難以完全有效控制該病，發掘致病疫霉拮抗微生物并研發安全高效的微生物農藥是當前的主要研究方向之一.綜述了近年來對于致病疫霉拮抗真菌的研究進展，并指出了在該領域中存在的一些問題和今后的研究重點，以期對馬鈴薯晚疫病的生物防治發揮推進作用.

拮抗真菌；致病疫霉；馬鈴薯；番茄

致病疫霉(Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary)在Cavalier-Smith 1988年創建的生物八界系統中，屬于藻界卵菌門卵菌綱腐霉目腐霉科疫霉屬(Phytophthora)[1]，主要引起馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)和番茄(S.lycopersicumL.)的晚疫病，常造成毀滅性災害，嚴重制約著馬鈴薯和番茄生產的發展.而馬鈴薯是僅次于小麥、玉米和水稻的世界四大糧食作物之一，每年因晚疫病所造成的損失全球達到170億美元，中國約達到40億美元,該病的危害性、防治難度及其對全社會造成的影響已超過了水稻稻瘟病和小麥銹病，被視為國際第一大作物病害[2].生產中主要通過培育和推廣抗病品種、農業栽培措施和化學農藥防治該病，但由于病菌生理分化明顯、A2交配型在世界各地相繼出現、以及有限的抗病品種和化學農藥所造成的選擇壓力，致使病菌生理小種變異迅速[3]、品種抗性喪失加快，尤其是化學防治帶來的環境污染、病菌抗藥性、毒物殘留等一系列問題嚴重威脅著生態環境以及人類健康，因而研發高效、生態、環保、無毒的生物農藥已成為植物病理學領域中的重要研究課題.

許多學者嘗試利用植物及其提取物[4-9]或拮抗微生物及其代謝產物抑制致病疫霉[10]，或誘導馬鈴薯增強對致病疫霉的抗性[11-14]，尤其是自從Malajczuk(1983)報道對致病疫霉的拮抗微生物以來，研究涉及到的微生物有真菌[15]、細菌[16]、放線菌[17]和病毒[18]等.其中，真菌是自然界中種類最多、分布最為廣泛的一類微生物，利用真菌及其代謝產物抑制致病疫霉已有許多研究，包括重寄生、內生、腐生和植物病原真菌或弱致病真菌等，其中研究和應用最多的是木霉屬(Trichodermaspp.)真菌[19]，其他有寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)、鐮刀菌(Fusariumspp.)、黑斑病菌(Alternariaspp.)、青霉菌(Penicilliumspp.)等.本文結合本研究室多年的研究工作較為系統地介紹了國內外對致病疫霉拮抗真菌的研究進展，分析了拮抗真菌的利用潛力，同時也指出了在該領域中存在的一些問題和今后的研究重點，以期加快對致病疫霉拮抗微生物的利用.

1 拮抗真菌的主要類型

1.1重寄生真菌

重寄生真菌是對其他植物病原菌具有寄生作用的真菌，迄今研究較深入的主要是木霉屬(Trichoderma)的一些種和腐霉屬中的寡雄腐霉(Pythiumoligandrum).Trichoderma屬的T.harzianum，T.viridae和T.atroviride等幾個種可寄生在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、茄鐮孢(Fusariumsolani)、辣椒疫霉(Phytophthoracapcisi)、寄生疫霉(Phy.payrasitica)、瓜果腐霉(Pyt.aphanidermatum)、寬腐霉(Pyt.dissotacum)、終極腐霉(Pyt.ultimum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、核盤菌(Scleortiniasclerotiorum)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)等30多種植物病原真菌上[19]，而其中的T.viridae[20]和T.atroviride[21]均可寄生在致病疫霉(Phy.infestans)上；Lacey[20]認為帶有致病疫霉菌絲體和孢子囊的土壤，隨時間延長侵染性顯著下降，其主要原因之一是T.viridae的寄生作用所致，因為致病疫霉菌絲體的生長和孢子囊的萌發在無菌土壤中可正常進行，而在含有T.viridae的土壤中不能進行；McBeath[21]研究發現T.atroviride對生長條件的要求幾乎與致病疫霉完全相同，都喜好冷涼和高濕的環境，它對致病疫霉的A1和A2交配型的寄生強度相同，也對化學農藥瑞毒霉(ridomil)表現抗性，用T.atroviride處理馬鈴薯種薯切塊后，切塊萌發早而整齊，萌發率為100%(與未處理的對照相同)，而瑞毒霉處理后的萌發率為88%；人工接種致病疫霉后，T.atroviride處理對馬鈴薯晚疫病的防效與瑞毒霉相同甚至優于瑞毒霉，由于抵抗致病疫霉A1交配型的馬鈴薯品種均高度感染A2交配型[21]，因此，T.atroviride處理馬鈴薯種薯防治馬鈴薯晚疫病具有很好的應用前景.

此外，El-Hasan等[15]也對幾種木霉屬(Trichodermaspp.)真菌的抗菌活性進行了研究，并首次報道了哈茨木霉(T.harzianum)T16和T23菌株產生的抗生素viridiofungin A(VFA)的抑菌作用，證實VFA(150 μg/mL)可明顯抑制致病疫霉孢子囊的萌發，抑制率達到60%以上，并顯著抑制大麗輪枝菌(V.dahliae)、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)和枝孢屬真菌(Cladosporiumspp.)的菌絲生長，抑制率可達到90%以上，且揮發性成分也有抑制卵菌和真菌的作用，但VFA對細菌無抑制作用.Arora[22]通過在實驗室、溫室和大田中篩選防治馬鈴薯晚疫病的菌株，發現T.viride和Acremoniumstrictum等幾種微生物均能夠阻止致病疫霉的孢子囊萌發或抑制壞死斑形成或兩者兼而有之，其中T.viride能阻止孢子囊不同部分的細胞質進入游動孢子中，A.strictum能夠溶解塊莖中的病菌細胞；在溫室中用A.strictum或T.viride的懸浮液(108mL-1)防治馬鈴薯晚疫病，顯著降低了晚疫病的發病率.國內在這方面報道較少，孟艷等[23]測定了一種木霉菌(Trichodermasp.)T115D菌株發酵濾液對致病疫霉的抑制作用，結果顯示，發酵濾液對致病疫霉孢子囊直接萌發、游動孢子釋放和游動孢子萌發均有抑制作用，但對菌絲生長的抑制作用不明顯；發酵濾液原液對孢子囊直接萌發的抑制率為57.60%，對孢子囊釋放游動孢子的抑制率為75.01%，對游動孢子萌發的抑制率為60.02%.

寡雄腐霉(Pyt.oligandrum)是另一種被研究較多的重寄生真菌.Picard等[24]研究表明Pyt.oligandrum可寄生在疫霉屬(Phytophthora)和腐霉屬(Pythium)的多個種上，例如寄生疫霉(Phy.parasitica)、瓜果腐霉(Pyt.aphanidermatum)和終極腐霉(Pyt.ultimum).雖然對于Pyt.oligandrum是否寄生致病疫霉以及寄生程度未見相關報道，但Kurzawińska等[25]研究表明由Pyt.oligandrum開發成的廣譜生物殺菌劑多利維生(polyversum)可有效防治由致病疫霉、立枯絲核菌(R.solani)和茄長蠕孢(Helminthosporiumsolani)等引起的馬鈴薯塊莖儲藏期病害，該制劑已被廣泛應用.

1.2植物內生真菌

植物內生真菌是指生活在健康植物體內、或至少在其生活史中的一段時間生活在植物體內，但對植物不形成有害侵染的一類真菌，由于它們對植物具有多方面的功能，例如為植物提供營養物質、促進植物生長、提高植物的生態適應性、增強植物對逆境的抵抗能力等，因而利用植物內生真菌控制植物病害已受到許多學者的關注[26].在抑制致病疫霉方面，Kim等[27]從黃瓜、紅辣椒、番茄、南瓜和大白菜等植物的66種健康組織中分離出了152株內生真菌，有23株內生真菌的發酵濾液在番茄幼苗上顯示出明顯的抗卵菌活性和防治晚疫病的效果，保護率達到90%以上，其中經鑒定為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的EF119 菌株對番茄晚疫病的防治效果最好.該菌株不僅顯著抑制致病疫霉菌絲生長、且明顯抑制終極腐霉(P.ultimum)和辣椒疫霉(P.capsici)等其他卵菌的生長.Son等[28]從上述EF119 菌株培養液中獲得了2種抗卵菌活性物質，經質譜和核磁共振鑒定分別為比卡菌素(bikaverin)和鐮刀菌酸(fusaric acid)，這2種活性物質不僅對番茄晚疫病顯示出良好的防治效果，2者(比卡菌素300 μg/mL、鐮刀菌酸100 μg/mL)的防效分別為71%和67%，而且明顯抑制其他一些卵菌和真菌菌絲的生長，鐮刀菌酸還能抑制許多植物病原細菌的生長.這表明EF119菌株極有潛力用作防治番茄晚疫病的生物制劑.

此外，Prada等[29]發現分離自一種植物(Espeletiasp.)、經鑒定為間座殼屬(Diaporthesp.)的內生真菌，也能明顯抑制致病疫霉菌絲的生長，但抑制效果隨實驗中所用培養基的種類而有差異，表明培養條件也影響其抑制效果，該研究小組還克隆了上述菌株中與抗生作用相關的編碼淀粉酶的基因，并在體外得到了表達.蘇珍珠等[30]從7種植物中分離出了11株內生鐮刀菌，并研究了它們對致病疫霉的抑制活性，結果顯示這11株內生鐮刀菌對致病疫霉均有抑制作用，其中菌株e060-1，e060-3和e060-4的活體抑制率在50%以上，這些菌株的毒素粗提液對致病疫霉菌絲生長有更明顯的抑制作用，其中e012-3，e060-4和e032毒素粗提液的抑菌率均達到100%，且發現毒素粗提液能明顯抑制致病疫霉孢子對離體葉片的侵染，其中菌株e032毒素粗提液的抑制率達 97.10%.

1.3植物病原真菌

植物病原真菌均有一定的寄主范圍，因而對植物的致病性是相對的，一種病原真菌對有些植物能致病，對另一些植物則不能致病；同樣，在同一種病原真菌范圍內，有些菌株致病性強，有些菌株則弱，還有一些則完全不致病.因此，利用無致病力或弱致病力的植物病原真菌菌株防治植物病害也受到了許多學者的關注.本研究室郭會婧等[31]通過菌體對峙培養，從36株微生物中共篩選出了10株對致病疫霉菌絲生長有抑制作用的微生物，包括多種真菌、細菌和放線菌等，抑菌率均在50%以上；但這10株菌中只有白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae(Berk.)Sacc.)BH-09和梨黑斑病菌(A.alternata(Fr.)Keissle)LH-03的發酵液對致病疫霉表現出較強的抑制作用，抑菌率分別為80.51%和70.21%.劉海珍等[32]優化了A.alternataLH-03的發酵條件，發現在28 ℃、自然pH、80 mL/250 mL裝液量、6%接種量、黑暗培養 8 d后所得發酵液對致病疫霉的抑制作用最強，抑菌率可達85.71%，優化后的抑制率提高了約 15%，表明該菌株在抑制致病疫霉生長方面有進一步研究和利用的潛力.蔣繼志等[33]研究了瓜果腐霉(P.aphanidermatum)、刺腐霉(P.spinosum)、畸雄腐霉(P.irregulare)、終極腐霉(P.ultimum)、立枯絲核菌(R.solani)、膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、細交鏈孢(Alternariaalternate)和大麗輪枝菌(V.dahliae)共8種植物病原真菌不同體積分數發酵液對致病疫霉的影響，發現對菌絲生長、游動孢子靜止、靜止孢萌發等不同生長發育階段均有一定程度的抑制作用，并隨發酵液體積分數增加抑制作用逐漸增強，發酵液體積分數為100%時的抑制率最高；其中以立枯絲核菌發酵液的抑制作用最強(抑菌率為90.42%)，而靜止孢的萌發率僅為2.41%，附著胞及侵入絲均未見形成.

1.4青霉菌

青霉屬(Penicillium)真菌在自然界廣泛存在，其中由青霉屬的產黃青霉(P.chrysogenum)產生的青霉素(penicillin)是最早用于治療人類疾病的抗生素，迄今仍在廣泛應用.因而，利用這一類真菌抑制致病疫霉似乎比其他拮抗真菌更有潛力.趙明剛[34]報道圓弧青霉(P.cyclopium)能產生抗生素圓弧菌醇，對致病疫霉菌絲生長的抑制率能達到95.00%，認為是一種特異的天然殺卵菌劑；Arora[22]在篩選致病疫霉拮抗菌中發現，P.viridicatum和P.aurantiogriseum均能夠阻止致病疫霉的孢子囊萌發，并抑制馬鈴薯葉片受致病疫霉侵染后壞死斑的形成，顯微觀察表明P.viridicatum能使致病疫霉形成大量敗育的孢子囊，從而阻止其危害.從心黎等[35]研究了一種廣譜性昆蟲寄生真菌YX 擬青霉菌(Paecilomycesfarinosus)的發酵液濃縮物對致病疫霉的抑制作用，結果顯示2 g/L的發酵液濃縮物(YFC)對菌絲生長具有較強的抑制作用，抑制率達63.00%，而用4 g/L的YFC在盆栽實驗中對馬鈴薯晚疫病的預防和治療效果分別為83.35%和35.63%.

1.5其他真菌

Nagaoka等[36]從動物堆肥中分離出了1株對多種植物病原菌均有較強抑制作用的蘑菇輪枝菌(Verticilliumpsalliotae)，并明確了該菌株產生的抗生素oosporein對致病疫霉菌絲生長和孢子囊萌發的抑制活性遠高于對其他病原真菌的作用，該oosporein有希望開發成為抑制致病疫霉等卵菌的特效生物農藥.Eschen-Lippold等[37]從象牙白蠟傘(Hygrophoruseburneus)真菌中提取的活性物質γ-Oxocrotonate脂肪酸對致病疫霉(P.infestans)、黃瓜黑星病菌(Cladosporiumcucumerinum)和馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)等多種病菌孢子萌發和菌絲生長均有一定抑制作用，且發現該不飽和脂肪酸無毒副作用，提前噴霧馬鈴薯植株可有效防治馬鈴薯晚疫病和炭疽病，具有廣闊的商業開發前景.劉曉蕓等[38]發現半知菌附球菌屬黑附球菌(Epicoccumnigrum)的3個菌株(XF1,XF2,XF3)對致病疫霉均有較強的拮抗作用，在對峙培養中的抑菌帶寬度均可達16 mm，且抑菌帶寬度不隨時間的推移而顯著改變，尤其以XF1的抑菌作用最為明顯，并明確了XF1菌株產生的蛋白和多糖無明顯抑菌作用，分泌至胞外的物質經去除多糖后對孢子囊和菌絲生長的抑制中質量濃度(EC50)分別為576.3 μg/mL和850.1 μg/mL，而粗脂肪對孢子囊萌發的抑制中質量濃度為1 301.1 μg/mL，同時發現該抑菌物質能耐受100 ℃的高溫處理.

2 拮抗真菌的復合抑菌作用

許多研究表明，將不同種的微生物或同種內不同菌株進行混合發酵，借助于發酵過程使不同種的微生物或不同菌株以及所產生的發酵產物之間發生互補、協同、增效或減少反饋抑制，可以事半功倍，獲得更高產量或更強活性的目標產物，這在農業、工業、醫藥、環保、食品、酶制劑[39]等方面均有廣泛應用，但在抑制植物病原微生物方面的報道還不多見[40].本實驗室郭會婧等[31]將36個單一菌株的發酵液兩兩復合后，發現部分復合發酵液表現出了明顯的增效作用，其中增效作用最顯著的是A.alternataLH-03和A.brassicaeBH-09質量濃度為10 mg/mL的復合發酵液，抑菌率最高(90.38%)，而2種發酵液單一使用時的抑菌率分別為80.51%和70.21%.蔣繼志等[41]在通過對峙培養明確了A.alternataLH-03和A.brassicaeBH-09相互之間無拮抗作用的基礎上，對這2個菌株進行了混合發酵，并明確了其混合發酵的條件，在pH 6.29，25 ℃靜置中黑暗培養4 d后所得混合發酵液在較低濃度下(7 mg/mL)就顯示出對致病疫霉很強的抑制作用，抑菌率可達92.15%.李莎等[42]進一步優化了這2株菌的混合發酵條件，在降低接種量，將A.brassicaeBH-09先培養24 h后再以等接種量(菌餅數相同)接入A.alternataLH-03，所得混合發酵液對致病疫霉的抑制率可以達到87%以上.桂春爽等[43]將A.alternataLH-03和放線菌NB-8先進行單獨發酵，再將獲得的發酵液按不同比例進行復配，發現2者以2∶1體積比復配后對致病疫霉的抑制作用最強(抑菌率96.81%)，顯著優于單獨發酵的抑菌率.這些結果均顯示出不同菌株發酵液復配或進行混合發酵明顯優于單獨發酵.

3 拮抗真菌的抑菌機理

拮抗真菌可通過多種機制對植物病原微生物發揮抑制作用，主要包括對病原菌的抗生、競爭、重寄生以及誘導植物的抗病性或促進植物生長而增強對病菌的抵抗能力[15]等.從心黎等[35]研究表明，用YX 擬青霉菌(P.farinosus)的發酵液濃縮物(2 g/L)處理后，不僅顯著抑制致病疫霉菌絲生長，且使大部分菌絲體發生扭曲，分枝增多或局部膨大、變形甚至斷裂，但對孢子囊釋放游動孢子和游動孢子的萌發幾乎沒有抑制作用；當提高發酵液濃縮物的質量濃度(4 g/L)后能明顯抑制游動孢子的釋放(抑制率達93.36%).本研究室經過反復研究[31,42,44]也證實A.alternataLH-03和A.brassicaeBH-09 2種拮抗真菌的發酵液(4～6 mg/mL)、或2者的復配發酵液、以及由A.alternataLH-03和放線菌NB-8的復配發酵液，均能使致病疫霉菌絲細胞內的原生質濃縮，菌絲表面凹凸不平，扭曲、膨大成節節狀或斷裂等，同時可使游動孢子的釋放率明顯降低或完全不能釋放游動孢子，有些孢子囊的內含物向四周擴散而中央形成空腔——類似“大眼睛”結構，有些孢子囊則變形扭曲甚至破裂.桂春爽等[44]、朱琳等[45]進一步研究表明受A.alternataLH-03、A.brassicaeBH-09、放線菌NB-8和核桃細菌等拮抗菌的單獨發酵液或復配發酵液抑制后，緊靠抑菌帶邊緣(0 mm)的致病疫霉菌絲轉接培養后通常不能恢復生長，而遠離抑菌帶邊緣(20 mm)的菌絲約在轉接后第3天開始恢復生長，到第7天時的生長速率接近對照，而介于這2者之間(10 mm)的菌絲轉接后，約在第5天開始恢復生長，至第10天時的生長速率接近對照.這些結果說明，拮抗菌發酵液對致病疫霉的作用方式主要是抑制其生長，而不是將其完全殺死.朱琳等[45]還檢測了受上述拮抗菌發酵液抑制后又恢復生長的致病疫霉體內多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化，發現3種酶活均顯著下降，與對照相比，分別下降了56.50%，42.50%和85.00%.

4 問題與展望

植物病害的生物防治已有百余年的歷史，研究報道的拮抗菌也已有很多，但真正被開發成為生產中可大規模應用并形成產業化的生防制劑卻為數很少，遠遠不能滿足農業生產可持續發展的需求.篩選獲得的許多拮抗菌，在平板上能完全抑制病菌的生長(抑菌率100%)[30]，其防病效果在離體組織上可達到95%以上，盆栽試驗中可達到90%以上，溫室中也能達到80%以上[35]，但在大田中的防病效果則急劇下降甚至完全無效，致使許多原本性狀優良的菌株中途夭折，不得不放棄，在致病疫霉拮抗菌的篩選和晚疫病的生防試驗中也是如此.造成這種現狀的原因是多方面的，但筆者認為其中最根本的一個原因是傳統的拮抗菌篩選方法存在一定缺陷.傳統的篩選方法是通過對峙培養將待篩選菌株與靶標菌置于一對一的無菌培養體系中，由此獲得抑菌作用顯著的拮抗菌，再進行其發酵液的抑菌活性測試以及更深入的研究工作.但在實際生產中這種拮抗菌與靶標病原菌的一對一無菌關系是根本不存在的，而依照這樣的思路篩選獲得的單一拮抗菌又如何能充分抑制靶標病原菌呢？因此，在篩選拮抗菌過程中，改變思路和更新觀念就顯得十分必要和迫切，尤其是對傳統的拮抗菌篩選模式進行改進，甚至開創一種全新的拮抗菌篩選體系勢在必行.例如同時在一個平板中篩選多種待測試菌株，或模擬自然土壤條件而非無菌條件進行篩選或將2種及2種以上待篩選菌株混合，或將其單獨發酵后再將發酵液按一定比例混合[43]，或直接進行混合發酵[41]等，均有可能對穩定拮抗菌在自然條件下的抑菌效果和防病能力發揮積極作用.

隨著人類社會的進步和經濟文化生活水平的提高，無公害農業生產正日益受到人們的重視，微生物制劑因其無毒、無害、無污染、病菌不產生抗藥性且防效高，無疑是解決當前因大量化肥、農藥使用造成的環境污染日益突出最具潛力的途徑之一，尤其是微生物資源十分豐富，種類多、分布廣，是獲得高效生物農藥的巨大天然寶庫，盡管在針對包括致病疫霉在內的植物病原菌的拮抗微生物的篩選中還存在許多亟待解決的問題，但已有的部分研究結果已經顯示出了非常誘人的前景[21,25,28,35-37]，尤其是隨著研究思路的不斷更新和新方法、新技術的不斷涌現，可以預料在不久的將來，生防制劑可以大幅度減少或大部分代替農藥和化肥的使用，以真正實現高效益、低成本、環境安全、產品優良的可持續農業生產.

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(責任編輯：趙藏賞)

AdvancesofantagonisticfungiagainstPhytophthorainfestans

JIANGJi-zhi,GUOJun-ting,LILi-yan

(College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China)

Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary causes late blight of potato and tomato, and is the first important factor limiting sustainability for potato and tomato production all over the world.Current resistant varieties, agricultural cultivations, and chemical fungicides could not completely and effectively control the late blight sinceP.infestanshas evident physiological differentiation and quick hereditary variation.To explore antagonistic fungi and develop safe and high effective microbial pesticide againstP.infestansis one of the main study fields at present.In order to carry out biological control of potato and tomato late blight, the progress on antagonistic fungi toP.infestansin recent years were reviewed, and some problems existing in this field and research highlight were pointed out.

antagonistic fungi;Phytophthorainfestans; potato; tomato

Q945.8

A

1000-1565(2012)01-0105-08

2011-08-12

河北省自然科學基金資助項目(C2011201003)

蔣繼志(1960-)，男，寧夏中寧人，河北大學教授，主要從事生物化學與分子生物學研究.

E-mail: jiangjizhi@yahoo.com