干細胞修復缺血性心肌損傷研究進展

韋艷綜述，吳冰審校

(蘭州軍區總院保健一部，甘肅蘭州730050)

干細胞修復缺血性心肌損傷研究進展

韋艷綜述，吳冰*審校

(蘭州軍區總院保健一部，甘肅蘭州730050)

干細胞移植修復缺血性心肌損傷已取得很好的收益，可減小梗死面積，提高左心功能和心臟灌注。目前輸注的方法主要有冠狀動脈內注射及心肌注射等。但仍存在一些問題：如移植干細胞存活率低、衰老并喪失多向分化能力等。如何優化干細胞的類型、移植方式及輸注時機，是將來的研究方向。

干細胞；缺血性心肌損傷

盡管治療心肌梗死有了長足的進展，心梗后慢性心衰仍然是個難解決的醫學難題。目前的藥物及介入治療并不能使已經死亡的心肌再生。越來越多的證據表明：心肌可以通過干細胞的激活獲得再生。雖然目前具體的機制仍不清楚，但許多動物實驗已經證實缺血性心肌損傷后基質干細胞移植可減少梗死面積，提高心臟灌注和射血分數。因此，干細胞治療有望成為目前治療缺血性心肌病的有效方法。

1 心臟干細胞治療的基本概念

早在20世紀90年代，Anversa就提出心肌在一定程度上凋亡的觀點，挑戰了心肌不能再生的傳統觀念。有人報告了心肌再灌注后3～5 h后，移植雄性轉基因鼠C-kit陽性骨髓細胞于雌性鼠，新形成的心肌占據了左心室大部分梗死面積。新形成的心肌細胞來源通過綠色熒光蛋白表達和Y染色體的方法得到鑒定。Ki-67(一種細胞復制的標記物)表達于4%的梗死心肌周圍的心肌細胞核中，預示著心肌細胞復制和再生的發生。

Mirotsou等[1]通過將骨髓間充質干細胞注射在小鼠心肌梗死區域，證實骨髓間充質干細胞能有效地降低心肌梗死小鼠的死亡率，減少心肌梗死瘢痕形成面積，提高心功能。Noiseux等[2]通過臨床實驗對69例心肌梗死患者靜脈注射骨髓間充質干細胞，結果顯示這些患者的左室功能明顯提高。

盡管如此，干細胞移植進行心臟修復的機制仍有爭議。實驗表明，移植骨髓來源的干細胞進入轉基因鼠的梗死心肌，內皮細胞和平滑肌細胞增生，并證實來源于供者干細胞。然而，一些實驗室沒能重復出上述實驗，移植細胞僅能顯示該干細胞系的表面標志。

2 人類的心臟干細胞治療

干細胞治療能在很大程度上提高左心室的功能，這種新方法很快應用于人類。但仍有很多問題尚待解決，如：應用何種類型的移植細胞，應用何種移植方法，何時為心梗后最恰當的移植時機，如何能提高移植細胞的生存率，移植細胞于人類心肌是否具有再生能力等。

遺憾的是，目前仍沒有干細胞心臟移植的具體細節及應用指南。當前，不同類型的再生細胞(胚胎干細胞、骨骼成肌細胞、骨髓來源細胞等)被應用于心肌修復的研究。然而，不同類型的細胞均具有不同的優缺點，例如：胚胎干細胞具有倫理學和免疫源性的問題，骨骼成肌細胞不能顯示出其生理功能，當前，非選擇性骨髓單核細胞、CD34+干細胞及循環祖細胞也被應用于人類實驗中。目前的移植方法主要包括：靜脈注射、冠脈注射及心肌注射。靜脈注射包括：1)冠狀靜脈：血管內超聲引導，僅完成了一小部分臨床實驗；2)外周靜脈：僅一小部分細胞到達了心肌，在心肌梗死后很短時間內細胞能夠定居于心肌。冠狀動脈注射是最常用的方法，操作簡便且經濟，但仍在安全性及有效性方面缺乏依據。心肌注射用于開胸手術中和心臟血管搭橋術中，包括：1)經心外膜途徑：高有創性，缺乏對照組，且并非所有部位均可注射；2)經血管內皮途徑：以介入導管為基礎的。

3 急性心梗后冠脈內干細胞移植

最早期的小型臨床試驗證實了急性心梗后自體骨髓干細胞移植的可行性及安全性。第一例急性心梗后經皮冠脈內干細胞移植，顯著地減少了梗死面積從(30±13)%至(12±6.7)%。一項大型、隨機對照研究顯示干細胞治療對左室功能及心肌灌注有益。在TOPCARE-AMI實驗中[2]，急性心梗后(4.9±1.5)d經冠狀動脈途徑輸注骨髓或外周血干細胞于梗死相關動脈，1年后行對比增強核磁共振檢查提示可顯著提高左室射血分數，減少梗死面積。在骨髓細胞(BMC)移植改善ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者心肌再生(BOOST)試驗中[3]，成功實施經皮冠狀動脈介入治療的STEMI患者60例，隨機分為對照組和細胞治療組。研究表明，BMC移植后6個月，左心射血分數(LVEF)增加2.8%(P=0.003)，18個月時增加6.0%(P= 0 27)。BMC移植后(61±11)個月，對所有存活者的LVEF和臨床預后進行重新評估，LVEF通過磁共振成像評估。結果表明，兩組患者主要不良心臟事件發生頻率相似。在REPAIR-AMI研究[4]中，心梗后患者輸注骨髓間充質干細胞(BMSCs)，LVEF提高了(5.5%±7.3)%，顯著高于安慰劑對照組的(3.0±6.5)%；隨訪1年，治療組在病死率、心肌梗死(MI)復發率、血管重建方面有更好的預后。

在TACT-PB-AMI試驗[5]中納入54例患者于心肌梗死后3 d進行外周血干細胞移植，細胞數量為5×109/L，通過左心室造影檢測，患者射血分數提高13%；Cardiac Study試驗[6]中為38例心梗后4 d的患者輸入41.8×107骨髓干細胞，單光子發射計算機斷層成像術(SPECT)檢測射血分數提高了13.1%。在急性心梗的治療中，干細胞治療能長期提高心室功能，射血分數提高3%～36%(平均11.4%)，梗死面積減少1%～60%(平均34%)，大多數移植時間在梗死后8～14 d進行。雖然各組試驗結果相差甚遠，但均可明顯提高梗死心臟功能，造成結果差別的原因可能在于：1)干細胞制備的不同方法導致細胞生存能力的差別；2)患者年齡差別；3)輸注干細胞數量及輸注時機不同；4)由于血管阻塞或無效輸注，無法計算進入交界區的細胞數量；5)評估心臟功能的方法不同等原因。

4 干細胞治療缺血性心力衰竭

12例嚴重的晚期心力衰竭患者伴難治性心絞痛，平均左心室射血分數為20%，已經無其他選擇重建血運。有人從他們的坐骨收集了50 ml骨髓，提取單個核細胞，4 h后，又將這些細胞應用NOGA系統注入患者的心臟。治療后4個月，LVEF提高了20%～29%，心臟收縮末期容積減小，通過電機械標測系統檢測干細胞治療區域，心肌機械收縮能力提高。Tse等[7]對于8例無選擇的缺血性心力衰竭患者，通過NOGA系統注射干細胞于缺血區域，3個月后心絞痛發作及硝酸甘油用量減少。對于5例需要做心臟移植的嚴重缺血性心力衰竭患者，通過心肌注射干細胞治療后，他們的缺血心肌面積減小，活動能力提高。最近的一項臨床試驗STAR中，納入了391例慢性心衰患者，NYHA分級III級，射血分數≤35%，經過3個月至5年的骨髓干細胞治療，顯著提高射血分數、心臟指數、運動耐量及左室收縮等；更重要的是，與對照組相比，患者死亡率降低，P＜0.01[8]。

5 急性心梗后聯合冠狀動脈及心肌注射干細胞治療

維也納醫學院首次應用NOGA系統引導心肌注射聯合冠狀動脈內輸注自體骨髓干細胞，獲得了陽性結果之后，啟動了一項針對急性心梗后干細胞治療的多中心、隨機、雙盲臨床實驗，以評估冠狀動脈內輸注聯合心肌注射自體骨髓干細胞于梗死心肌邊界區域的療效[9]。近期曾有ST段抬高的心梗患者和急性心梗后至少3周梗塞相關動脈再通伴LVEF在30%～45%的患者，共360例患者入組。實驗結果證實，干細胞治療有益于提高LVEF和心肌存活，主要歸功于心肌注射治療[10]。

在已發表的文獻中，急性心梗后但LVEF＞45%的患者是排除于干細胞治療之外的，左室收縮功能基本正常、沒有絞痛及嚴重的冠狀動脈狹窄且預后較好的患者，干細胞治療的益處沒有定論。因應用NOGA系統的高風險性，倫理委員會禁止對LVEF＜30%的患者進行干細胞治療。

盡管早期應用干細胞治療急性心梗可能更有效，但由于梗死早期心室功能的自然恢復，局部心室壁運動改善影響干細胞治療的效果；局部炎癥反應及氧化應激反應對移植細胞產生危害；梗死后脆弱的心肌且心電不穩定，進行有創診斷和治療的安全性差。因此心肌梗死后3周進行治療效果更好。

6 目前干細胞治療存在的問題

盡管目前干細胞治療已有一定的成效，但對人或實驗動物進行冠狀動脈輸注及心肌注射的干細胞，約有90%在輸注后數小時內死亡[11-12]。Hou等[13]報道冠狀動脈輸注、心肌注射干細胞后幾小時僅有2.6%和11%的仍存留在心臟中，大多數細胞進入肺臟、外周循環或肝脾等臟器，保留的細胞被吞噬或凋亡。由于局部缺血、無處定居及炎癥反應，干細胞逐漸衰老，端粒縮短，喪失復制能力。

細胞老化及不同程度心血管風險因素影響干細胞的遷移和功能。Hill等[14]研究表明循環的內皮祖細胞的數量與受試者Framingham危險評分(根據膽固醇水平和非膽固醇因素計算個體未來10年冠心病發作幾率)呈反比。檢測肱動脈流量介導的擴張反應也提示內皮功能與內皮祖細胞數量具有相關性。循環血中內皮祖細胞的數量比傳統的風險因素更能夠預測血管反應。具有高風險的心血管病患者的血管內皮祖細胞比低風險人群體外培養更容易衰老。而且，需要考慮的問題包括可能將抗原帶入心肌或冠脈、應用其他種類的細胞、細胞準備、培養方法及基于細胞的基因治療等。

7 展望

胚胎干細胞具有從內皮細胞分化為心肌細胞的潛能，可用于心肌梗死的修復，而且可通過縫隙連接傳導電和機械信號于宿主心肌細胞。然而也存在許多問題，如形成畸胎瘤、誘發心律失常、同種異體排斥反應及釋放細胞因子。脂肪組織來源的間充質干細胞表達表面抗原Sca1和CD44，不表達c-kit、lin、CD11b、CD31、CD34、CD45，類似于骨髓間充質干細胞，可通過血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor)誘導血管生成。另外，來自于經血的子宮內膜干細胞、前列腺干細胞及胎盤干細胞等治療心臟缺血損傷仍在研究中。

另外，研究者嘗試通過基因修飾提高移植細胞的存活率和功能。早期的研究將激活的端粒酶亞單位或端粒酶反轉錄酶轉入內皮祖細胞用于急性心梗的治療。VEGF高表達可促進血管生成并提高左室功能。Penn[15]也觀察到混合培養的心肌細胞和骨骼肌成肌細胞轉染VEGF后，移植入心肌疤痕后1周后存活率提高。其最主要的機制是通過誘導血管生成，對移植細胞起支持作用，從而提高細胞生存。據報道，轉染VEGF的心肌細胞移植至心肌疤痕，可顯著提高局部血流和血管密度。另一重要機制是血管擴張效應。擴張疤痕周圍區域的小動脈和毛細血管可提高局部血流灌注，促進移植細胞存活。但由于VEGF與炎癥因子及生長因子的相互作用，可促進斑塊進展。馬樹人等[16]通過逆轉錄病毒介導轉染Notch基因(ICN)激活Notch信號轉染BMSCs，轉染的BMSCs向內皮細胞分化過程中缺血心肌中VEGF mRNA及VEGF蛋白表達明顯增加，表明Notch信號有促進BMSCs向內皮細胞分化的作用，為心梗后心肌血管重建提供了一條新的思路。

另一種有潛力的基因是PTEN，該基因是目前發現的第一個具有特異性磷酸酶活性的抑癌基因，能通過抑制Akt途徑而使Bcl-2蛋白表達減少，從而促進細胞凋亡。雷瑩等[17]通過脂質體法將PTEN基因特異的siRNA轉染入骨髓間充質干細胞，證實沉默PTEN基因能有效促進骨髓間充質干細胞的增殖，使細胞周期向右偏移，同時能抑制細胞凋亡，增強細胞對缺血缺氧的耐受能力，并進行體內實驗證實PTEN基因沉默后的骨髓間充質干細胞更容易在心肌梗死區域存活和增殖。

另外，為提高移植細胞的存活率，國內外不少研究集中于提供細胞良好的生長環境，以及能使其發揮功能的新型生物相容性支架材料。崔曉軍等[18]利用自聚肽納米纖維支架承載骨髓源性心肌干細胞移植治療大鼠心肌梗死。結果發現，支架承載MCSC移植組的Y染色體陽性細胞排列整齊，分布比較集中；微血管密度也顯著增加，膠原纖維含量均明顯減少，左心室功能改善顯著，差異均具有非常顯著的統計學意義。

目前，干細胞移植治療缺血性心肌損傷已取得了長足的進展，將來研究的方向主要集中在優化干細胞類型、移植時機、輸注方式及干細胞預處理等方面，應用前景十分廣闊。

[1]Mirotsou M,Zhang Z,Deb A,et al.Secreted frizzled related protein 2(Sfrp2)is the key Akt-mesenchymal stem cell-released paracrine factor mediating myocardial survival and repair[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(5):1643-1648.

[2]Noiseux N,Gnecchi M,Lopez-Ilasaca M,et al.Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation[J].Mol Ther,2006,14(6):840-850.

[3]Wollert KC,Meyer GP,Lotz J,et al.Intracoronary autologous bone marrow cell transfer after myocardial infarction:the BOOST randomised controlled clinical trial[J].Lancet,2004,364:141-148.

[4]Scha chinger V,Erbs S,Elsa sser A,et al.Intracoronary bone marrow derived progenitor cells in acute myocardial infarction[J].N Engl J Med,2006,355:1210-1221.

[5]Matsubara H,Murohara T,Ikeda K,et al.Angiogenic cell therapy by bone marrow and peripheral blood mononuclear cells for patients with ischemic limbs(TACT)and AMI(TACT-PB-AMI)[J]. Jpn Circ J,2007,70(1):26.

[6]Piepoli MF,Vallisa D,Arbasi M,et al.Bone marrow cell transplantation improves cardiac,autonomic,and functional indexes in acute anterior myocardial infarction patients(Cardiac Study)[J].Eur J Heart Fail,2010,12:172-180.

[7]Tse HF,Kwong YL,Chan JK,et al.Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation[J].Lancet.2003,361:47-49.

[8]Strauer BE,Yousef M,Schannwell CM.The acute and long-term effects of intracoronary stem cell transplantation in 191 patients with chronic heart failure:the STAR heart study[J].Eur J Heart Fail, 2010,12:721-729.

[9]Gyongyosi M,Sochor H,Khorsand A,et al.Online myocardial viability assessment in the catheterization laboratory via NOGA electroanatomic mapping:quantitative comparison with thallium 201 uptake[J].Circulation.2001,104:1005-1011.

[10]Nyolczas N,Gyongyosi M,Beran G,et al.Design and rationale for the Myocardial Stem Cell Administration After Acute Myocardial Infarction(MYSTAR)study:a multicenter,prospective,randomized,single-blind trial comparing early and late intracoronary or combined(percutaneous intramyocardial and intracoronary)administration of nonselected autologous bone marrow cells to patients after acute myocardial infarction[J].Am Heart J,2007,153:1-7.

[11]Hofmann M,Wollert KC,Meyer GP,et al.Monitoring of bone marrow cell homing into the infarcted human myocardium[J].Circulation,2005,111:2198-2202.

[12]Freyman T,Polin G,Osman H,et al.A quantitative,randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery follow in myocardial infarction[J].Eur Heart J,2006,27: 1114-1122.

[13]Hou D,Youssef EA,Brinton TJ,et al.Radiolabeled cel ldistribution after intramyocardial,intracoronary,and interstitial retrograde coronary venous delivery:implications for current clinical trials[J].Circulation,2005,112:150-156.

[14]Hill JM,Zalos G,Halcox JP,et al.Circulating endothelial progenitor cells,vascular function,and cardiovascular risk[J].N Engl J Med,2003,348:593-600.

[15]Penn MS.Cell based gene therapy for the prevention and treatment of cardiac dysfunction[J].Nature.2007,4(Suppl 1):83-88.

[16]馬樹人,謝雄偉.激活Notch信號的骨髓間充質干細胞移植促心肌梗死模型鼠血管新生研究[J].蘇州大學學報(醫學版),2011,31 (1):93-97.

[17]雷瑩,陳杭,許紅,等.PTEN基因的沉默對骨髓間充質干細胞體外生物學特性和體內移植治療心肌梗死的影響[J].臨床心血管病雜志,2011,27(4):307-312.

[18]崔曉軍,譚玉珍,謝華,等.自聚肽納米纖維支架承載骨髓源性心肌干細胞移植治療心肌梗死的實驗研究[J].生物醫學工程與臨床,2011,15(4):303-307.

Advance research of stem cells in the repair of ischemic myocadium.

WEI Yan,WU Bing.Cadre Ward,General Hospital of Lanzhou Millitary Command,Lanzhou,730050,Ganshu,CHINA

Using stem cells in the repair of ischemic myocadium has alreay got good returns,which can reduce infarct scar size and improve left ventricular function and myocardial perfusion.The delivery method mainly includes intracoronary injection and intramyocardial delivery.But there are still some problems in transplanted stem cells,such as low survival rate,aging and lose the ability of replication.Further clinical research should aim to optimize the cell types utilized and their delivery mode,as well as the time of cell transplantation.

Stem cell;Ischemic Myocadium

R542.2

A

1003—6350(2012)08—119—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.08.057

2011-10-11)

韋艷(1977—)，女，江蘇省連云港人，主管護師，學士，主要研究方向：心血管基礎與臨床。

*通訊作者：吳冰(1975—)，男，甘肅省天水市人。Email：wbb1124@yahoo.com.cn