IGKV基因在人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療前后的變化分析

姚智強(qiáng)，盧亦成，姚 蘭，賈竹敏，鄭 魯，劉忠于，劉軼剛

腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤的77%～80%，嚴(yán)重影響著人類的健康。在過(guò)去的40多年時(shí)間里，隨著對(duì)膠質(zhì)瘤各項(xiàng)研究的深入，諸多生物治療方法已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但膠質(zhì)瘤患者的平均生存時(shí)間并未得到明顯改善。目前對(duì)膠質(zhì)瘤主要采用手術(shù)加放化療等綜合性治療，但并未能根治膠質(zhì)瘤患者[1]。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)放射敏感性差異是導(dǎo)致腫瘤治療效果差及局部復(fù)發(fā)率、殘留率高的一個(gè)重要原因。以往僅能用PCR、Northern blot或Western blot研究個(gè)別環(huán)節(jié)的個(gè)別或幾個(gè)基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)差異與放射敏感性的關(guān)系，無(wú)法很好地在分子水平上闡明腫瘤放射敏感性機(jī)理[2]。我們用含13 929條人類全長(zhǎng)基因cDNA表達(dá)譜芯片對(duì)5例對(duì)放射治療敏感的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人同時(shí)進(jìn)行放射治療前及放射治療60 Gy后免疫相關(guān)基因表達(dá)變化的檢測(cè)，以研究放射治療后免疫相關(guān)基因表達(dá)的改變，進(jìn)行如下探討。

1 材料與方法

1.1對(duì)象48例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本取自第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科及中國(guó)人民解放軍第150中心醫(yī)院神經(jīng)外科2006～2009年手術(shù)切除的組織。選取其中5例對(duì)放射治療劑量60 Gy敏感性較好的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者,于放療前及放療后進(jìn)行檢測(cè)。5例患者男3例，女2例，平均年齡45.7歲；對(duì)照3例正常腦組織標(biāo)本來(lái)自于捐獻(xiàn)的標(biāo)本。標(biāo)本組織分2份，1份送病理檢查，1份立即放液氮中凍存。

1.2方法基因表達(dá)譜芯片采用上海博星基因芯片公司提供的BioStarH-141s型基因表達(dá)譜芯片，含有14 112點(diǎn)的人類全長(zhǎng)基因cDNA表達(dá)譜芯片。其中包括陽(yáng)性對(duì)照96點(diǎn)，陰性對(duì)照16點(diǎn)，內(nèi)參基因20點(diǎn)，空白對(duì)照41點(diǎn)。芯片經(jīng)水合(2 h)、室溫干燥(0.5 h)、UV交連(能量值65 mj/cm)，再分別用0.2% SDS、水及0.2%硼氫化鈉溶液處理10 min，晾干備用。

2 結(jié)果

2.1 cDNA芯片掃描及數(shù)據(jù)分析結(jié)果對(duì)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤cDNA芯片掃描圖使用GenePix Pro3.0軟件提取數(shù)據(jù)并進(jìn)行去除冗余和標(biāo)準(zhǔn)化處理，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放療60 Gy后組織與正常組織比較。Ratio值>15的1個(gè)免疫球蛋白變異因子(immunoglobulin kappa variable, IGKV);Ratio值<0.03的3個(gè)，如富脯氨酸蛋白連接因子4(proline-rich protein BstNI subfamily 4, PRB4)、硫酸叢生糖蛋白(clusterinlysis sulfated glycoprotein CLSG)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3(transforming growth factor,beta 3, TGFB3)等。

2.2多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放療60 Gy后與放療前組織比較表達(dá)差異基因中改變最明顯的功能群是免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因，如IL1RN等上調(diào)。細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)系統(tǒng)也有部分基因發(fā)生明顯變化，如MLL5上調(diào)、POLR2B下調(diào)等。

3 討論

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是人類惡性程度極高、預(yù)后不佳的腫瘤之一，嚴(yán)重影響著人類的生命和生活質(zhì)量，已有研究表明可用SF2來(lái)預(yù)測(cè)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株或組織的放射敏感性，提示根據(jù)癌細(xì)胞受照射60 Gy后的改變即可判斷放射敏感性[3]。但通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來(lái)觀察的終點(diǎn)指標(biāo)，牽涉到細(xì)胞培養(yǎng)、時(shí)間長(zhǎng)等復(fù)雜因素，目前臨床仍然無(wú)法應(yīng)用，因此很有必要對(duì)其中間指標(biāo)，如基因表達(dá)等進(jìn)行研究，以探討放射敏感性的分子生物學(xué)機(jī)理及尋找標(biāo)志基因。

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放療60 Gy前后差異表達(dá)基因中改變最明顯的基因，包括與中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、免疫球蛋白、組織相容性蛋白HLA、細(xì)胞因子以及免疫細(xì)胞活化、增殖、死亡、信號(hào)傳遞途徑等相關(guān)的基因，這些基因在放療前或放療后的組織與正常組織對(duì)比大多數(shù)未見(jiàn)表達(dá)差異[4]。免疫球蛋白類的基因IGKV表達(dá)也明顯上調(diào)。該基因除調(diào)節(jié)促濾泡激素的分泌、雄激素合成、免疫調(diào)節(jié)、紅細(xì)胞分化、細(xì)胞的增殖和分化外,對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用[5]。

Runx1基因具有在DN期細(xì)胞調(diào)節(jié)CD4沉默子功能，Runx1缺乏時(shí)CD8表達(dá)降低，CD4去抑制加劇。FN1表達(dá)下調(diào)，它與非受體蛋白酪氨酸激酶TEC家族結(jié)合，參與B細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖和凋亡過(guò)程，在其信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中處于重要位置[6]。綜上所述，免疫相關(guān)基因絕大多數(shù)表現(xiàn)為上調(diào)，極少數(shù)下調(diào)也是為了減少免疫細(xì)胞的凋亡或免疫抑制細(xì)胞數(shù)。總的來(lái)說(shuō)，放療60 Gy后，腫瘤組織出現(xiàn)局部免疫增強(qiáng)現(xiàn)象，這可能是射線作用于腫瘤組織后首先造成組織損傷，如自由基破壞血清中的蛋白酶抑制劑，同時(shí)增強(qiáng)彈性蛋白酶的作用，直接造成組織損傷，機(jī)體應(yīng)急而出現(xiàn)免疫增強(qiáng)，包括固有免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答。提示對(duì)腫瘤組織而言，射線及免疫反應(yīng)有共同殺傷的作用。

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