電噴霧電離四極桿質譜直接進樣定性檢測化合物實驗條件的研究

趙逸松 宋學英 薛 冰

(首都醫科大學醫學實驗與測試中心，北京 100069)

質譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等優點［1］。對于表征有機化合物而言，第一步和最重要的步驟就是快速準確地確定相對分子質量，電噴霧電離四極桿質譜恰好滿足了這樣的要求，成為藥物化學合成實驗不可缺少的檢測工具之一。本文中用到的質譜是Waters公司的型號為Quattro microTMAPI的電噴霧電離四極桿質譜，它的可測質荷比范圍為2～2 000 m/z，適用于小分子化合物檢測，所以可用于藥物化學實驗反應中間產物、目標化合物以及副產物的定性檢測。

電噴霧電離是一種通用電離技術，在藥物研究中可以成功地分析80%以上的有機化合物，因而成為表征藥物分子的常用方法。電噴霧電離的原理是溶液經過一根高溫和加有高電壓的毛細管后形成霧狀溶液，在強電場的作用下，霧狀溶液的液滴帶有過量同種電荷，在高溫環境中隨著液滴溶劑的進一步揮發，液滴逐漸變小，液滴表面電荷劇增。當電荷之間的靜電排斥力與液滴的表面張力相等時，液滴發生崩解，形成更小的液滴，此過程反復進行，最終形成氣相離子進入質量分析器［2］。

四極桿性能穩定可靠、造價低，是最常見的與電噴霧電離離子源連接的質量分析器，該分析器由四根平行的金屬桿組成。四根金屬桿分成2組，一組加上直流電壓，另一組加上具有一定振幅與頻率的交流電壓。只有質荷比適于四極桿電壓和頻率要求的離子才可以沿金屬桿之間的軸線飛行到達檢測器。不能滿足這種要求的離子將與金屬桿相撞，中和電性，成為不帶電荷的氣體分子被真空泵抽出系統。有規律地改變加在四極桿上的電壓或頻率，在檢測器上便可記錄到不同質荷比的離子信號，完成質譜測定［3］。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Quattro microTMAPI電噴霧電離四極桿質譜(美國，Waters公司);2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);軟件為masslynx 4.0;1810-B型石英自動雙重純水蒸餾器(常州國華電器有限公司)。

甲醇為色譜純(中國百靈威公司);實驗用水為三蒸水;0.45 μm針式過濾器(英國Whatman公司)。實驗樣品為藥物化學合成實驗過程中得到的中間產物、目標化合物。

1.2 樣品準備

取微克級樣品用可揮發溶劑溶解，通常使用的溶劑為色譜甲醇、色譜乙腈、色譜異丙醇或超純水，不具備制作超純水的條件也可以使用三蒸水。對于甲醇、乙腈、異丙醇和水都不溶的少數樣品可使用少量四氫呋喃或氯仿將樣品溶解后用甲醇或乙腈稀釋后再進樣。

樣品充分溶解后要根據溶劑選擇有機相或水相針式過濾器對樣品進行過濾，用過濾后的樣品直接進樣。

1.3 質譜條件

離子源為電噴霧電離源，毛細管電壓為3 kV;錐孔電壓根據樣品性質在10～100 V之間調諧;源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為350℃;脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣，脫溶劑氣流量為350 L/h，錐孔氣流量為50 L/h;直接進樣時將樣品帶入質譜的流動相水的比例為30%，甲醇的比例為70%，流速設為0.2 mL/min;進樣量為 10 μL。

1.4 Quattro microTMAPI電噴霧電離四極桿質譜直接進樣過程

(1)根據樣品性質選擇電噴霧電離的正負模式。

(2)用微量注射器取樣品溶液約100 μL，將注射器固定在六通閥的接口上旋緊。

(3)按MS tune界面左下角Acquire按鈕，在彈出對話框中，編輯掃描模式、樣品名和掃描的質核比范圍，按Start按鈕開始采集離子流信號，按六通閥右側Load按鈕，推注射器進樣約30～50 μL，然后按Inject按鈕進樣。

(4)在Chromatogram界面采集總離子流信號并去除本底離子流信號，在Spectrum界面得到質譜圖。

(5)得到滿意的質譜圖后，點擊MS Tune界面快捷按鈕欄上的“手”標志按鈕，終止離子信號采集進程。

(6)每做完一個樣品，清洗微量注射器10～15次，清洗六通閥上的定量環3～4次。

2 結果

如果樣品經過充分的分離純化，樣品能夠充分溶解，樣品的電離效率也比較理想，質譜的參數設置恰當的話，就可以得到一張比較理想的全掃描質譜圖?？梢钥吹酱郎y樣品的準分子離子峰就是基峰，雜質離子峰和噪音峰強度很弱，樣品濃度較大時還可以看到強度較低的二聚體的準分子離子峰，相對分子質量較大的化合物還可以看到三聚體帶兩個電荷的準分子離子峰。錐孔電壓參數設置恰當可以減弱目標離子的碎片離子信號強度，避免對全掃描質譜圖解析造成干擾。但如果想進一步得到目標離子的碎片離子信息則還需要對目標離子進行子離子掃描，通過調諧碰撞室的碰撞能量獲得理想的子離子掃描質譜圖。

3 討論

樣品的濃度、基質、pH值、化合物的表面活性、流動相的流速、質譜參數等許多因素會對電噴霧電離的離子信號強度有影響［4-6］。以下是結合實際工作經驗，對電噴霧電離四極桿質譜定性檢測化合物的實驗條件的探討。

3.1 樣品需要純化

電噴霧電離非常靈敏，樣品需要進行純化，盡量消除樣品和溶劑中的各種鹽和雜質，避免化學噪聲和電離抑制。

樣品中鹽的濃度太高會抑制電離，一般要求揮發性無機鹽濃度應小于20 mmol/L，不揮發性無機鹽濃度應小于5 mmol/L。

表面活性劑存在于洗滌劑中，使用洗滌劑洗過的瓶皿處理樣品會將表面活性劑帶入樣品，表面活性劑雖然會降低液滴表面張力，能增加從噴霧液滴中釋放出離子，但其又具有較高的質子親和力，通過和樣品離子爭奪質子會降低樣品離子信號的靈敏度。

此外樣品中含有的不揮發物質可能會污染質譜元件，會對其他樣品的質譜圖造成干擾。例如藥物化學有機合成的樣品常常會有三乙胺存在，這種物質的相對分子質量為101 000，電噴霧電離正離子模式時在質譜圖上會看到強度很高的質荷比為102的加氫的準分子離子峰，這種情況下如果想觀察質荷比200以下的離子，就很困難，而且三乙胺會存留在質譜中較難除去對后面的樣品質譜圖造成的干擾，所以樣品要盡量純化。

3.2 所需樣品量

樣品量一般取微克級即可。樣品量過少可能造成檢測不到目標化合物或質譜圖的基線噪音強度太高而影響譜圖效果。樣品量過多則會出現離子信號過飽和，離子源內電流過大產生放電現象損傷儀器，而且多余樣品殘留會污染質譜不易清洗，還會對后面的樣品造成干擾。但有些樣品離子化效率高，較低濃度下也能得到很好的離子信號，而有些離子化效率低的樣品則需要適當加大濃度或調節pH值促使目標離子峰信號增強，這時則需要根據實際情況決定樣品量。

3.3 樣品的溶劑

溶解樣品的溶劑通常使用甲醇、乙腈、異丙醇和水。甲醇、乙腈和異丙醇要選用色譜純試劑，避免試劑中的本底離子對質譜結果造成干擾。建議使用超純水，超純水是應用蒸餾、去離子化、反滲透等技術生產出來的水，這種水中除了水分子外，幾乎沒有什么雜質。用于質譜分析也是為了避免水中的本底離子對質譜分析結果造成干擾。由于制造超純水的成本較高，有的實驗室不具備制造超純水的條件，如果三蒸水中的本底離子沒有對質譜結果造成干擾則使用三蒸水也可以。對于甲醇、乙腈、異丙醇和水都不溶的少數樣品可以使用四氫呋喃或氯仿做溶劑，但這些溶劑會促使質譜的塑料管路和橡膠墊圈老化，所以要加少量這類溶劑將樣品溶解后用甲醇或乙腈稀釋后再進樣。

3.4 樣品的pH值

pH值是影響電噴霧電離的重要因素。有些樣品通過調整pH值可以得到理想的目標分子離子峰。堿性化合物用正離子模式檢測，可以用有機酸調整pH值，酸性化合物用負離子模式檢測，可以用堿調整pH值。調整pH值的有機酸一般用甲酸或乙酸，堿一般用氫氧化銨。強腐蝕性和不易揮發的酸堿不能用，會損壞污染質譜元件。高效液相常用的三氟醋酸不能用，它會明顯抑制陰離子電噴霧電離，而當三氟醋酸超過0.01%的水平時，也會在一定程度上抑制陽離子電噴霧電離。

3.5 樣品的過濾

質譜的進樣管路很細小，為防止溶液中的顆粒堵塞進樣管路，樣品充分溶解后要根據溶劑選擇有機相或水相的針式過濾器過濾，用過濾后的樣品進樣。在選擇針式過濾器的時候需要注意，需要先用空白溶劑用針式過濾器過濾后進樣，查看過濾后的本底離子，有些濾膜使用溶劑過濾后會產生一些強度很高的本底離子，會對質譜結果造成干擾，影響化合物的分析。所以要選擇對質譜結果本底干擾小的針式過濾器。

3.6 質譜參數的優化

用電噴霧電離四極桿質譜檢測樣品時需要對離子源參數進行優化調諧，調諧的目的是得到較強的目標分子離子峰。當用電噴霧電離四極桿質譜進行液相色譜質譜聯用對化合物進行定量檢測時，每一個離子源參數都要進行優化調諧。而利用直接進樣的方式進行大量藥物化學實驗反應中間產物、目標化合物以及副產物等小分子化合物的快速定性檢測時，如果每做一個樣品都將所有參數優化一遍不但浪費樣品而且十分耗時。所以直接進樣時一般只需調諧錐孔電壓，其他參數設置在相對合適的范圍內通常就可以得到理想的結果。下面對部分可以調諧的參數做一下簡要說明:

(1)毛細管電壓:在探頭內部的毛細管上加上高電壓，高電壓使樣品液滴帶上過量電荷，從而離子化。電壓值過低會導致樣品的離子化效率低，電壓值過高則容易引起放電現象。通常在2～4 kV之間優化，直接進樣時通常設為3 kV。

(2)錐孔電壓:錐孔電壓對電噴霧電離的信號強度影響較大，也是直接進樣時通常需要調諧的參數。加大錐孔電壓會增加離子間的碰撞，使離子進入檢測器的速度加快，離子損失小，檢測靈敏度高，離子信號增強，但會發生源內裂解，產生碎片離子。降低錐孔電壓，則檢測的靈敏度會變低，但產生的碎片離子會減少。通過實踐發現一般相對分子質量在100 000～400 000的化合物錐孔電壓可以在10～30 V之間優化，相對分子質量在400 000～700 000的化合物錐孔電壓可以在30～50 V之間優化，相對分子質量在700 000～1 950 000的化合物可以在50～150 V之間優化。但有少數化合物并不符合上述規律，有的化合物相對分子質量較小卻需要較大的錐孔電壓才能得到理想強度的分子離子峰，而有的化合物相對分子質量較大卻需要相對較小的錐孔電壓，在實際工作中應該注意這樣的情況。

(3)源溫度:源溫度設定主要根據進入質譜的流動相的流速大小和流動相含水比例高低來決定，如果流動相流速較大、流動相含水的比例高、不容易氣化則需要較高的源溫度。通常在80℃ ～120℃之間優化。直接進樣時需要利用高效液相的流動相將樣品帶入質譜，通常將流動相水的比例設為30%，甲醇的比例設為70%，流速設為0.2 mL/min，源溫度設為120℃。

(4)脫溶劑氣溫度:脫溶劑氣溫度設定也要根據進入質譜的流動相的流速大小和流動相含水比例高低來決定，如果流動相流速較大、流動相含水的比例高、不容易氣化則需要較高的脫溶劑氣溫度。通常在120℃～300℃之間優化。直接進樣時流動相水的比例為30%，甲醇的比例為70%，流速設為0.2 mL/min，脫溶劑氣溫度設在200℃。

(5)脫溶劑氣流量:脫溶劑氣主要的作用是去除溶劑。樣品需要利用流動相帶入質譜，如果流動相流速大、流動相含水的比例高、不容易氣化則脫溶劑氣流量應大些。通常在300～1 000 L/h之間優化。直接進樣時一般設為350 L/h。

(6)錐孔氣流量:錐孔氣的主要作用是去除樣品中的中性分子。通常在0～100 L/h之間優化。直接進樣時一般設為50 L/h。

電噴霧四極桿質譜是環境監測、食品衛生、醫藥等領域中重要的檢測工具［7-10］。有機化合物的定性檢測是電噴霧電離四極桿質譜最基本的應用技術，掌握起來并不難。對于已知化合物，根據它的相對分子質量和化學結構特性就可以基本確定實驗條件，得到較理想的質譜圖。而對于未知樣品則需要在正負電噴霧電離模式下都進行測定，根據結果再參考以上所述對實驗條件進行進一步調整，最終得到理想的質譜圖。

［1］何美玉.現代有機與生物質譜［M］.北京:北京大學出版社，2002.

［2］帕拉馬尼克，甘古利，格羅斯.電噴霧質譜應用技術［M］.蔣宏鍵，俞克佳譯.北京:科學出版社，2005.

［3］汪聰慧.有機質譜技術與方法［M］.北京:中國輕工業出版社，2011.

［4］楊芃原，錢小紅，盛龍生.生物質譜技術與方法［M］.北京:科學出版社，2003.

［5］Constantopoulos T L，Jackson G S，Enke C G.Effects of salt concentration on analyte response using electrospray ionization mass spectrometry［J］.J Am Soc Mass Spectrom，1999，10(7):625-634.

［6］Rundlett K L，Armstrong D W.Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry［J］.Anal Chem，1996，68(19):3493-3497.

［7］王紹楠，袁東.色譜-質譜聯用技術在環境監測中的應用［J］.廣東化工，2011，38(1):177-178.

［8］牛增元，羅忻，葉曦雯.色譜質譜技術在消費品安全檢測中的應用進展［J］.檢驗檢疫學刊，2011，21(4):1-5.

［9］李曉東，林琳，丁麗霞.液質聯用技術在藥品質量控制中的應用(上下)［J］.中國藥師，2010，13(5):645-647.

［10］彭翱，趙芊，江驥，等.質譜在生物標志物研究中的應用［J］.中國藥師，2011，32(1):31-35.