牙齦卟啉單胞菌PG0839基因突變株的構(gòu)建

[摘要] 目的 構(gòu)建牙齦卟啉單胞菌毒力島基因PG0839突變菌株，為研究PG0839基因功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 擴(kuò)增1 584 bp PG0839基因片段，對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物和pUC19載體進(jìn)行BamH Ⅰ和EcoRⅠ雙酶切，連接酶

切產(chǎn)物得到質(zhì)粒pPG0839-1。將2 101 bp erm基因產(chǎn)物插入到pPG0839-1中PG0839基因的EcoRⅤ位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pPG0839-2，作為電穿孔的供體質(zhì)粒。電穿孔轉(zhuǎn)化于受體菌牙齦卟啉單胞菌W83菌株，紅霉素抗性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，命名為PG0839基因突變菌株。結(jié)果 運(yùn)用插入失活方法構(gòu)建PG0839基因突變菌株，進(jìn)而通過酶切、測(cè)序、PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)PG0839基因突變菌株進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)PG0839基因突變菌株構(gòu)建成功。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建PG0839基因突變菌株。

[關(guān)鍵詞] 牙齦卟啉單胞菌； 毒力島； 基因打靶

[中圖分類號(hào)] R 781.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.020

Construction PG0839 gene-defective mutant of Porphyromonas gingivalis Liu Jingbo1， Pan Yaping1， Li Chen1， Lin Li1， Zhong Ming2，3. （1. Dept. of Periodontology， School of Stomatology， China Medical University， Shenyang 110002， China; 2. Central Laboratory， School of Stomatology， China Medical University， Shenyang 110002， China; 3. Dept. of Oral Pathology， School of Stomatology， China Medical University， Shenyang 110002， China）

[Abstract] Objective In order to determine the function of PG0839 gene from Porphyromonas gingivalis（P.gin-

givalis） W83 strains， we intended to create a mutant in the PG0839 gene by homologous recombination. Methods 1 584 bp PG0839 gene fragment was amplified， digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ， purified and ligated to pUC19. The recombinant plasmid was designated as pPG0839-1. The erm cassette（2 101 bp） was inserted into the EcoR Ⅴ restric-

tion site of the PG0839 gene. The resultant recombinant plasmid， pPG0839-2， was used as a donor in the electropo-ration of P.gingivalis W83. After electroporated and selected on erythromycin brain heart infusion plates， a single colony was collected and designated as PG0839 gene-defective mutant. Results A mutant in PG0839 gene was created by insertional inactivation， and inactivation of PG0839 gene was confirmed by restriction endonuclease digestive， sequen-cing， polymerase chain reaction（PCR） and reverse transcription PCR. Conclusion A PG0839 gene-defective mutant

was created successfully.

[Key words] Porphyromonas gingivalis； pathological islands； gene targeting

病原菌毒力島是指編碼細(xì)菌毒力基因簇的相對(duì)分子質(zhì)量較大的染色體DNA片段。通過基因水平轉(zhuǎn)移，細(xì)菌獲得毒力島基因。毒力島編碼不同功能的毒力相關(guān)基因，影響細(xì)菌的毒力變化。PG0839基因是牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gin-

givalis）W83菌株P(guān)G0819—0844毒力島中的重要部分。在慢性牙周炎患者P.gingivalis陽性的齦下菌斑標(biāo)本中，毒力島基因PG0839檢出與牙周探診深度和探診出血指數(shù)之間的關(guān)系存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該基因

可能是慢性牙周炎的致病性基因[1]。目前許多學(xué)者通

過反向遺傳學(xué)方法進(jìn)行基因功能研究，即構(gòu)建目的基因敲除菌株后，通過對(duì)突變株表型變化的研究，獲得目的基因與細(xì)菌表型之間的相關(guān)性，從而獲知基因的功能[2]。本研究擬遵循反向遺傳技術(shù)路線，運(yùn)用

等位基因重組技術(shù)構(gòu)建PG0839基因突變菌株，為研究毒力島基因PG0839的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)菌株

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基（Di-fco Laboratories，美國(guó)）；DNeasy Tissue Kit（Qiagen公司，德國(guó)）；PrimeSTAR HS DNA聚合酶，DNA A-Tailing試劑盒，Dephospharylation（BAP）試劑盒，DNA片段純化試劑盒，DL 2000 DNA Marker，λ-Hind

ⅢDNA Marker，pUC19載體，引物（大連寶生物工程有限公司）；TGRADIENT型PCR擴(kuò)增儀（Biometra公

司，德國(guó)）；ECM630型電穿孔儀（BTX公司，美國(guó)）。

本研究采用了4種菌株。P.gingivalis W83由美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)牙科學(xué)院口腔微生物研究所Lamont RJ教授惠贈(zèng)，P.gingivalis ATCC 33277和變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）ATCC 2517由首都

醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院提供，大腸桿菌（Escherichia coli，

E.coli）JM109購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

P.gingivalis W83菌株接種于新鮮配制的含有5%無菌脫纖維羊血、氯化血紅素（5 μg·mL-1）和維生素K（0.5 μg·mL-1）的BHI培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)5～7 d（10% H2、10%CO2、80%N2）[3]。E.coli JM109菌株接種于Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基，37 ℃需氧培養(yǎng)。

1.3 P.gingivalis的檢測(cè)

提取P.gingivalis W83菌株DNA。使用P.gingivalis 16S rRNA特異性引物序列[4]進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（poly-merase chain reaction，PCR）。P1：5’-TGTAGAT-GACTGATGGTGAAAACC-3’，P2：5’-ACGTCAT-CCACACCTTCCTC-3’，預(yù)期產(chǎn)物片段為197 bp。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 45 s，退

火58 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后，延伸72 ℃ 10 min。分別以S.mutans ATCC 2517和等體積無菌去離子水作為PCR反應(yīng)的陰性和空白對(duì)照。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 PG0839基因的擴(kuò)增及克隆

1.4.1 PG0839基因擴(kuò)增和純化 根據(jù)PG0839基因序列（GenBank No：AE015924），使用Primer Premier

5.0軟件設(shè)計(jì)引物，使用BLAST對(duì)引物進(jìn)行同源性分析。P3：5’-CGGGATCCAGACTATCCCCTCGCCGT-AT-3’，P4：5’-CGGAATTCTCCTCTATTACTCCC-GCACT-3’。斜體部分分別為BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)。預(yù)期產(chǎn)物片段為1 584 bp（897 009～898 592 bp）。反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 2 min，變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 90 s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后，延伸72 ℃ 7 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。純化PCR產(chǎn)物，大連寶生物工程有限公司測(cè)序。

1.4.2 載體酶切、連接和轉(zhuǎn)化 PCR產(chǎn)物或pUC19載體經(jīng)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后，將純化后的PCR產(chǎn)物和載體連接，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感

受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆后增菌，提取質(zhì)粒后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，基因編碼區(qū)與參考序列一致，將該質(zhì)粒命名為pPG0839-1。

1.5 質(zhì)粒pPG0839-2的構(gòu)建

1.5.1 erm特異性引物PCR擴(kuò)增 質(zhì)粒pVA2198（Gen-Bank No：AF219231）中包含紅霉素抗性基因，可以在E.coli和P.gingivalis中表達(dá)出紅霉素抗性，由Wang BY教授（紐約州立大學(xué)布法羅分校牙學(xué)院口腔生物

系）惠贈(zèng)。

erm特異性引物[5]，P5：5’-TATTAGGCCTATA-GCTTCCGCTATT-3’，P6：5’-AATAGGCCTTAGT-AACGTGTAACTTT-3’，斜體部分為Stu Ⅰ酶切位點(diǎn)。預(yù)期產(chǎn)物片段為2 101 bp（11～2 111 bp）。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性98 ℃ 2 min，變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 90 s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后，延伸72 ℃ 10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。切膠純化后，產(chǎn)物進(jìn)行加A反應(yīng)。

1.5.2 質(zhì)粒pErm的構(gòu)建和酶切 將精制后的PCR產(chǎn)物和pMD19-T simple載體連接，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆后增菌，提取質(zhì)粒，命名為pErm，由大連寶生物工程有限公司測(cè)序。質(zhì)粒pErm經(jīng)Stu Ⅰ酶切后，得到2 101 bp的erm基因和2 692 bp的載體片段，回收2 101 bp目的片段。

1.5.3 質(zhì)粒pPG0839-2的連接和轉(zhuǎn)化 使用EcoR Ⅴ酶切pPG0839-1，酶切產(chǎn)物為線性片段（在目的基因中存在一個(gè)EcoR Ⅴ酶切位點(diǎn)，位于898 406 bp處）。將純化的酶切產(chǎn)物使用Dephospharylation（BAP）試劑盒進(jìn)行去磷酸化處理后，命名為pPG0839-1-EcoR Ⅴ（BAP）。使用DNA連接試劑盒連接純化的pPG0839-1-EcoRⅤ（BAP）和2 101 bp的erm基因片段。兩者平末端連接，將erm基因插入到目的基因之中，構(gòu)建成為一個(gè)新的質(zhì)粒?；厥漳康妮d體和片段，將精制后的PCR產(chǎn)物和載體連接，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選反向陽性克隆。提取質(zhì)粒DNA后，使用Hind Ⅲ進(jìn)行正反向酶切鑒定。同時(shí)，將質(zhì)粒DNA送至大連寶生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，與參考序列一致。將質(zhì)粒命名為pPG0839-2，該質(zhì)粒擴(kuò)增純化后用于電穿孔轉(zhuǎn)化。

1.6 載體的電穿孔轉(zhuǎn)化[5]

將1 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P.gingivalis W83菌液接種于10 mL新鮮配制的BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜。取3 mL過夜培養(yǎng)的菌液加入到90 mL新鮮配制的BHI液體培養(yǎng)基（預(yù)加熱至37 ℃）中，孵育4 h。

3 000 g、4 ℃離心15 min以收集細(xì)菌細(xì)胞，50 mL電穿孔緩沖液（10%甘油加1 mmol·L-1 MgCl2，過濾除

菌，4 ℃保存）洗滌2次后，0.5 mL電穿孔緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。將100 μL細(xì)胞懸液和1 μg DNA共同加入

到一個(gè)無菌電極杯中，電穿孔脈沖為2 440 V、5 ms，電穿孔后，冰浴5 min。

1.7 突變株的篩選

將細(xì)胞懸液接種于1 mL BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h后，取300 μL菌液接種于新鮮配制的抗性BHI培養(yǎng)基（含5 μg紅霉素），記為實(shí)驗(yàn)組；分別

在抗性和非抗性BHI培養(yǎng)基上接種P.gingivalis W83菌株，作為對(duì)照組1和2。37 ℃厭氧培養(yǎng)7 d。收集實(shí)驗(yàn)組中陽性克隆菌體，即為PG0839基因突變菌株。

1.8 突變株的檢測(cè)

1.8.1 P.gingivalis 16S rRNA特異性引物檢測(cè) 提取細(xì)菌DNA。對(duì)PG0839基因突變菌株進(jìn)行P.gingivalis 16S rRNA特異性引物P1和P2的PCR擴(kuò)增檢測(cè)。P.gin-givalis W83和ATCC 33277為陽性對(duì)照，S.mutans AT-CC 2517為陰性對(duì)照，等體積無菌去離子水為空白對(duì)照。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8.2 erm基因引物檢測(cè) 分別對(duì)質(zhì)粒pVA2198 DNA和PG0839基因突變菌株進(jìn)行erm基因引物P5和P6的PCR擴(kuò)增檢測(cè)。預(yù)期產(chǎn)物片段均為2 101 bp。P.gin-givalis W83為陰性對(duì)照，等體積無菌去離子水為空白對(duì)照。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8.3 PG0839引物檢測(cè) 分別對(duì)PG0839基因突變菌株和P.gingivalis W83進(jìn)行PG0839基因引物P3和P4

的PCR擴(kuò)增檢測(cè)。預(yù)期產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別為3 685 bp

（2 101 bp+1 584 bp）和1 584 bp。P.gingivalis ATCC 33277為陰性對(duì)照，等體積無菌去離子水為空白對(duì)照。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8.4 PG0839基因反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè) 提取細(xì)菌總

RNA，調(diào)整RNA質(zhì)量濃度至100 ng·μL-1。使用Pri-mer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，使用BLAST對(duì)引物進(jìn)行同源性分析。P7：5’-AAAGCGAATGTGGATAGG-

3’，P8：5’-CTATCCCATTAGGCAAGG-3’，預(yù)期產(chǎn)物片段為742 bp（897 662～898 403 bp）。30 ℃反轉(zhuǎn)錄

10 min，保溫42 ℃ 60 min，升溫至70 ℃，保持15 min后冰上冷卻。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性98 ℃ 2 min，變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 60 s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后，延伸72 ℃ 7 min。P.gingivalis 16S rRNA作為反應(yīng)的內(nèi)參照。分別以P.gingivalis W83、ATCC 33277和等體積無菌去離子水為反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)的陽性、陰性和空白對(duì)照。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.9 細(xì)菌生長(zhǎng)情況的測(cè)定

培養(yǎng)P.gingivalis W83和PG0839基因突變菌株，分別在2、4、8、12、16、22、28、32、48 h時(shí)取菌液，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量600 nm處光密度值。

2 結(jié)果

2.1 PG0839基因的克隆和載體連接

PG0839基因特異性引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖1所示。產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1 584 bp，包含PG0839全長(zhǎng)基因和部分上游和下游的非編碼DNA片段。P.gin-givalis PG0839 PCR產(chǎn)物和pUC19載體經(jīng)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，P.gingivalis PG0839 PCR產(chǎn)物酶切后片段長(zhǎng)度為1 584 bp，pUC19載體酶切后片段長(zhǎng)度為2 664 bp。質(zhì)粒pPG0839-1測(cè)序與GenBank中序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，基因編碼區(qū)序列與參考序列相符。

2.2 質(zhì)粒pPG0839-2的構(gòu)建

2.2.1 erm基因的擴(kuò)增 erm基因特異性引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖2所示。產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為2 101 bp。經(jīng)過加A反應(yīng)和純化處理后的erm PCR產(chǎn)物和pMD19-T simple載體連接，連接后質(zhì)粒命名為pErm。質(zhì)粒pErm測(cè)序結(jié)果與GenBank中erm基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，與參考序列相符。

2.2.2 質(zhì)粒pErm的酶切 質(zhì)粒pErm經(jīng)Stu Ⅰ酶切后，得到酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為2 101 bp和2 692 bp，如圖3所示。質(zhì)粒pPG0839-1經(jīng)EcoR Ⅴ酶切后，得到約為3 700 bp的產(chǎn)物片段。將酶切產(chǎn)物回收純化和去磷酸化處理后，命名為pPG0839-1-EcoR Ⅴ（BAP）。取

5 μL pPG0839-1-EcoR Ⅴ（BAP）進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖4所示。

2.2.3 質(zhì)粒pPG0839-2鑒定結(jié)果 連接pPG0839-1-EcoR Ⅴ（BAP）和載體構(gòu)建質(zhì)粒pPG0839-2。使用Hind Ⅲ對(duì)質(zhì)粒pPG0839-2進(jìn)行正反向酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳圖如圖5所示。質(zhì)粒pPG0839-2測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank中序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，與參考序列相符。

2.3 菌株篩選結(jié)果

厭氧培養(yǎng)7 d后，實(shí)驗(yàn)組可見白色、光滑的陽性

菌落生長(zhǎng)；對(duì)照組1未見細(xì)菌生長(zhǎng)，不僅表明P.gingi-valis W83菌株不具有紅霉素抗性，而且證實(shí)紅霉素在細(xì)菌培養(yǎng)基中有效；對(duì)照組2可見產(chǎn)黑色素圓形菌落生長(zhǎng)，符合P.gingivalis菌落形態(tài)特征，為P.gingi-valis W83菌株。

2.4 突變株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 P.gingivalis的檢測(cè)結(jié)果 PG0839基因突變菌株16S rRNA特異性引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖6所示。產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為197 bp。結(jié)果可見PG0839基因突變菌株為P.gingivalis。

2.4.2 erm基因的檢測(cè)結(jié)果 PG0839基因突變菌株erm基因引物PCR擴(kuò)增電泳圖如圖7所示。產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為2 101 bp。結(jié)果可見PG0839基因突變菌株基因組DNA中存在erm基因片段。

2.4.3 PG0839基因的檢測(cè)結(jié)果 PG0839基因突變菌株P(guān)G0839基因引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖8所示。P.gingivalis W83菌株的PG0839產(chǎn)物為1 584 bp，而PG0839基因突變菌株的PG0839產(chǎn)物為3 685 bp。結(jié)果可見：PG0839基因突變菌株基因組DNA中存在PG0839基因片段，但是該片段中插入了2 101 bp的erm基因片段。

2.4.4 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果 PG0839基因突變菌株P(guān)G0839基因引物反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增電泳圖如圖9所示。PG0839反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物為742 bp，內(nèi)參照P.gingivalis 16S rRNA反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物為197 bp。結(jié)果可見PG0839基因突變菌株為P.gingivalis，但是該菌株P(guān)G0839基因未轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的RNA。

2.5 菌株生長(zhǎng)情況

兩個(gè)菌株在12 h均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。PG0839突變菌株和P.gingivalis W83生長(zhǎng)速度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=25.50，P=0.19）。

3 討論

牙周炎是我國(guó)成年人失牙的主要原因之一，并與一些系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)[6]。P.gingivalis在牙周炎的病因?qū)W研究中，被認(rèn)為是重要的牙周可疑致病菌之一，與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。PG0839基因（GenBank ID：AAQ65990）全長(zhǎng)1 182 bp，編碼假

定的保守蛋白，為毒力島中的重要部分。PG0839基

因中包含著高毒力株P(guān).gingivalis W83菌株特有而低毒力株P(guān).gingivalis ATCC 33277中缺失的基因片段[7]。在前期研究[1]中，對(duì)P.gingivalis陽性的齦下菌斑標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著慢性牙周炎患者牙周組織炎癥程度的加重，PG0839基因檢出率呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，提示該基因與P.gingivalis的致病性密切相關(guān)。對(duì)于P.gingi-valis毒力島PG0839基因的功能了解還停留在結(jié)構(gòu)分析基礎(chǔ)上的推斷，因此P.gingivalis PG0839基因突變株的構(gòu)建為研究該基因的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

構(gòu)建基因突變株是從分子生物學(xué)的角度對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究的最主要手段，導(dǎo)致基因突變的理論依據(jù)是借助插入復(fù)制突變載體，依靠同源重組將一段載體序列整合進(jìn)入染色體。在P.gingivalis的轉(zhuǎn)化中，載體的選擇至關(guān)重要。近年來，一些研究小組已經(jīng)構(gòu)建了用于P.gingivalis的基因克隆載體，本次研究中使用的克隆載體pVA2198在P.gingivalis宿主中表達(dá)紅霉素抗性[8]。

使用同源基因DNA片段構(gòu)建載體，可提高同源重組效率，構(gòu)建能夠形成同源重組的質(zhì)粒，首先應(yīng)從P.gingivalis基因組DNA中克隆一段基因序列，該序列選擇在需要進(jìn)行基因突變的部位。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中同源序列的長(zhǎng)度對(duì)重組成功率有重要影響：同源片段長(zhǎng)度為300～2 500 bp時(shí)，隨著DNA片段長(zhǎng)度的增加，同源重組效率呈指數(shù)增加[9]。但是在PCR克隆該片段時(shí)，如果選擇片段過長(zhǎng)，錯(cuò)配率會(huì)增加，也會(huì)影響同源重組的效率。本研究以PG0839基因?yàn)槟０?，選取包含完整的PG0839基因和少量上下游基因的目的片段，長(zhǎng)度為1 584 bp，可以完整地?cái)U(kuò)增出野生型和突變后的該基因。

本次研究采用基因敲除的策略構(gòu)建了PG0839基因的同源重組載體，電轉(zhuǎn)化到P.gingivalis W83菌株，通過載體中PG0839基因序列與基因組DNA的同源序列發(fā)生同源重組，使基因組中PG0839基因由于外源基因的插入而失活。外源插入基因?yàn)榧t霉素抗性基因，在P.gingivalis W83菌株發(fā)生同源重組后，菌株

就表現(xiàn)出野生株不具備的紅霉素抗性。因此，可以

通過紅霉素抗性培養(yǎng)基來篩選陽性菌株。酶切、測(cè)序、PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，從基

因組DNA水平上說明外源基因erm已經(jīng)成功插入到PG0839基因中。

同時(shí)，以P.gingivalis PG0839蛋白編碼序列為模板，設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄PCR引物，引物位于PG0839基因內(nèi)部；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR證實(shí)PG0839基因未能轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)PG0839基因失活菌株構(gòu)建成功，為PG0839基因功能研究提供了有價(jià)值的細(xì)菌模型。

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（本文編輯 吳愛華）