多孔納米鈣磷陶瓷支架材料生物相容性評價

[摘要] 目的 評價多孔納米鈣磷陶瓷支架材料的生物相容性。方法 將多孔納米磷酸鈣陶瓷材料制成浸提液、混懸液、5 mm×5 mm×1 mm塊狀等體系，選擇健康新西蘭兔、昆明小鼠、SD大鼠為宿主，采用溶血試驗、凝血試驗、急性毒性試驗、熱原試驗、肌內降解來對其生物相容性進行評價。結果 材料對新鮮兔血的溶血度為1.1%，小于5%，在允許范圍內；血漿中凝血酶原時間、部分凝血活酶凝固時間、凝血酶凝固時間、纖維蛋白原4項指標結果無異常；熱原試驗顯示實驗組體溫升高分別為0.35、0.40、0.28 ℃，均小于0.60 ℃，符合生物醫學材料無熱原的評價標準；急性毒性試驗后小鼠無死亡，未觀察到步態不穩、驚厥、癱瘓、呼吸困難等不良反應；肌內埋植后觀察見新生纖維組織形成。結論 該陶瓷材料是一種安全無毒、無溶血性、對皮膚和肌肉無刺激作用、不含熱原物質的組織工程支架材料，其生物相容性良好，具有比普通鈣磷陶瓷支架材料更好的降解性能。

[關鍵詞] 納米材料； 支架材料； 磷酸鈣陶瓷； 生物相容性

[中圖分類號] R 318.08 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.02.024

Biocompatibility of porous calcium phosphate ceramic nanocomposite Zhang Kefu1， Zhang Shu1， Luo Zhiqiang1， Wang Jing1，2， Wang Tao3， Ou Guomin1，4， Wang Hu1，5. （1. State Key Laboratory of Oral Diseases， Sichuan University，

Chengdu 610041， China; 2. Dept. of Orthodontics， West China School of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China; 3. Dept. of Stomatology， Hainan Province People’s Hospital， Haikou 570311， China; 4. Dept. of Im-plantology， West China School of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China; 5. Dept. of Radiology， West China School of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China）

[Abstract] Objective To study the biocompatibility of porous calcium phosphate ceramics nanocomposite． Methods The biocompatibility was evaluated via experiments including the hemolysis test， hemopexis test， acute systemic toxicity test， pyrogen test， and intramuscular implant test， in which biphasic calcium phosphate nanocomposite（NanoBCP） pre-

sented as leaching solution， suspension or blocks of 5 mm×5 mm×1 mm. Animals including New Zealand Rabbits， Kun-ming mice， SD rats were selected as the host. Results The hemolysis of NanoBCP was 1.1%（＜5%）. Four coagula-tion index levels were within the normal range. In pyrogen test， the temperature of each experimental rat increased by 0.35， 0.40， 0.28 ℃（＜0.60 ℃， in accordance with the pyrogen-free criterion for biomedical materials）. No consequent death， dyspnoea， organ dysfunction， severe peritoneal irritation or ptosis was observed in acute systemic toxic test. Newly-formed fibrous tissue could be found after the implantation. Conclusion The material possesses outstanding biocompatibility and degradability with no toxicity or irritation， contains no pyrogen， as well as better degradation properties than biphasic calcium phosphate.

[Key words] nanocomposite； scaffolds； calcium phosphate ceramics； biocompatibility

創傷、炎癥、遺傳等原因造成的頜面骨缺損一直是臨床治療難點，盡管臨床有諸多方法如自體骨和異體骨移植以及其他生物材料來修復缺損，但各自的缺點限制了它們的應用[1-2]。近年來隨著組織工

程學和納米材料技術的發展，越來越多的支架材料相繼出現，其中，雙相鈣磷生物陶瓷作為一類由羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）和β-磷酸三鈣（β-trical-cium phosphate，β-TCP）按不同比例組成的硬組織

修復材料，借由磷酸三鈣的降解率和HA的骨傳導活性，可人為控制HA/β-TCP的比例，從而達到良好的成骨性能。近年來，隨著納米技術的研究深入，有實驗研究表明：納米生物材料能顯著提高與細胞的黏附能力，改善物理性能和增強生物降解性，這可能與納米材料大量吸附玻璃體結合蛋白有關[3-4]。研究發現：多孔納米鈣磷陶瓷材料相較普通鈣磷陶瓷材料，具有良好的細胞相容性和黏附性能[5-6]，但其組織與血液相容性如何尚缺乏有關研究基礎。本研究旨在探討納米型多孔雙相磷酸鈣陶瓷支架材料的生物相容性。

1 材料和方法

1.1 材料

5 mm×5 mm×1 mm大小納米雙相磷酸鈣（biphasic calcium phosphate nanocomposite，NanoBCP）陶瓷8

塊（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室），新鮮健康人血漿（四川大學華西口腔醫院檢驗科），Leica SP1600鋸式硬組織切片機（徠卡公司，德國），電子天平（上海亞津電子科技有限公司），微孔過濾器（漢斯希爾公司，德國）。

1.2 實驗動物

選取四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供的2.5～3.0 kg新西蘭兔2只、20～25 g昆明小鼠20只、2月齡180～200 g雄性SD大鼠48只。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶血試驗 心臟穿刺抽取新西蘭兔血15 mL，立即加入20 g·L-1草酸鉀0.5 mL，抗凝，取兔血8 mL加入10 mL生理鹽水中稀釋備用。將5 g納米雙相磷酸鈣材料切割成2 mm3大小塊狀，置入50 mL生理鹽水中，37 ℃下浸提24 h，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，制成浸提液。將兔血分為3組，具體如下。實驗組：在0.2 mL稀釋兔血加入10 mL浸提液；陰性對照組：在0.2 mL稀釋兔血中加入10 mL生理鹽水；陽性對照組：在0.2 mL稀釋兔血中加入10 mL雙蒸水，在離心速度為2 000 r·min-1條件下，將所有試管離心5 min，取上清液，在波長545 nm條件下使用分光光度計測量光密度值，每組取3次實驗的平均值。溶血度計算公式為：溶血度（%）=（試驗材料的光密度值-陰性對

照光密度值）/（陽性對照光密度值-陰性對照光密度值）×100%。評價標準為：溶血度大于5%為陽性反應，表示有溶血現象。

1.3.2 凝血試驗 取新鮮健康人血漿6 mL，分為3組，每組2 mL，每組各加入100 mg粉狀材料作為實驗組，實驗前后分別用自動血液凝固測定儀測定凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、部分凝血活酶凝固時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶凝固時間（thrombin time，TT）和纖維蛋白原（fi-brinogen，FIB），取均數作為平均值，觀察材料對凝血功能的影響。

1.3.3 熱原試驗 將納米雙相磷酸鈣陶瓷材料制成粉末狀，高溫高壓消毒條件下裝入盛滿生理鹽水的

鹽水瓶中，配制成100 g·L-1混懸液。以生理鹽水作為對照組。取新西蘭兔6只，質量在2.2～2.4 kg，其中實驗組和對照組各3只，用肛溫計測體溫，每只動物2次，每次隔30 min，取均數為正常值。將制備好的懸混液（或生理鹽水）按5 mL·kg-1劑量自兔耳緣靜脈緩慢注入，注射后每隔30 min測體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高一次減去正常體溫為該兔的體溫升高值。

1.3.4 急性毒性試驗 首先制備浸提液（制備方法如

溶血實驗）。選用健康成年的昆明小鼠20只，質量20～25 g，應用隨機數字法隨機分為2組，每組10只。實驗組以浸提液按50 mL·kg-1從尾靜脈注射，對照組小鼠尾靜脈注射同批號生理鹽水。觀察72 h，記錄動物有無死亡或不良反應。材料毒性程度根據中毒癥狀分為無毒、輕度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡。

1.3.5 肌內埋植試驗 取健康雄性SD大鼠48只，速眠新（復方制劑，含新保靈、氟哌啶醇、氯胺酮等）股部肌肉內注射麻醉，在大鼠腿部作長約1 cm切口，依次切開皮膚、皮下及筋膜，鈍性分離肌肉組織（肌

膜和肌肉），分別將納米雙相磷酸鈣、羥磷灰石陶瓷、普通雙相磷酸鈣陶瓷（biphasic calcium phosphate，

BCP）電子天平稱重（W0）后植入所形成肌袋內，切口分層縫合。術后2、4、12周分別處死12只動物（每

種材料組各4只），大體觀察標本后10%甲醛固定，順序脫水、甲苯透明、甲基丙烯酸甲酯浸泡后包埋，Lieca硬組織切片機以50 μm厚度連續切片，HE染色，光鏡下觀察材料降解情況。24周后處死余下12只動物，取出材料，用氫氧化鈉、過氧化氫、3∶1氯仿甲醇去除空隙內軟組織，然后110 ℃下烘烤24 h，自然冷卻后電子天平稱重（W1），降解率=（W0-W1）/W0×

100%。之后行硬組織切片（方法同上），HE染色，光鏡下觀察材料降解情況。

2 結果

2.1 溶血試驗

實驗各組光密度值測定結果見表1。

材料對新鮮兔血的溶血度為1.1%，對3組的溶血實驗測定結果運用成組設計多樣本比較的K-W秩和檢驗進行差異性檢驗，結果為?掊２=7.261，P=0.027。可以認為3組的溶血實驗測定結果分布不全相等，三者溶血度均小于5%，在允許范圍內。

2.2 凝血試驗

材料混合前后，血漿中PT、APTT、TT和FIB 4項指標檢測結果見表2。由表2可見，3組實驗前后4項指標水平均在正常值范圍內，可以認為多孔納米雙相磷酸鈣陶瓷不引起凝血功能的改變。

2.3 熱原試驗

3個實驗組測得最高最低溫度差取均值，實驗組體溫升高分別為0.35、0.40、0.28 ℃，每只新西蘭兔體溫升高度數均小于0.60 ℃，符合生物醫學材料無熱原的評價標準，可以認為納米雙相磷酸鈣陶瓷材料不含致熱原物質。

2.4 急性毒性試驗

實驗組小鼠的全身一般狀況良好，未見明顯毒性表現，體重無減輕，72 h觀察期內活動、進食均正常，無步態不穩、驚厥、癱瘓、呼吸困難等不良反應，無動物死亡現象。按急性毒性劑量分級，屬無毒級。

2.5 肌內埋植試驗

所有實驗動物術后一般情況好，傷口無感染，無排異現象。取材時見材料周圍肌肉組織顏色、質地正常。材料植入后2周植入物周圍有輕微炎癥細胞浸潤，未見巨噬細胞，纖維組織長入材料內部孔隙內，尚未形成規則排列的膠原纖維（圖1）。材料植入后4周植入物周圍肌肉組織形態正常，形成規則排列的膠原纖維，無炎細胞浸潤（圖2）。

材料植入后12周纖維排列規則，可見異物吞噬反應及多核巨細胞（圖3），部分區域見崩解后的小塊材料被纖維結締組織分割包繞，材料部分降解吸收并被新生纖維組織取代。

雙相磷酸鈣陶瓷、羥磷灰石陶瓷的降解率分別為35.47%、13.23%、3.03%，統計結果表明：術后24周3種材料降解率差異有統計學意義（P＜0.05）。組織學觀察見3種材料均維持塊狀形態，未見明顯炎癥反應，顯微組織包裹增厚，部分區域見崩解后的小塊材料被纖維結締組織分割包繞，并有少量多核巨細胞（圖4）。納米雙相磷酸鈣大部降解吸收并被纖維組織取代，可見材料小顆粒散在于纖維組織縫隙內（圖5）。

3 討論

生物相容性是指生命體組織對非活性材料產生反應的一種性能，一般是指材料與宿主之間的相容性，包括組織相容性和血液相容性[7-8]。本課題選擇了肌肉植入、溶血、凝血、熱原及急性全身毒性試驗等幾種較為常見的生物學試驗方法評價多孔納米陶瓷材料的組織與血液相容性。

溶血試驗的目的是通過材料在體外與血液直接接觸，測定紅細胞釋放的血紅蛋白量以評價材料是否對紅細胞的功能和代謝造成不良影響。當材料有溶血活動時證明其具有毒性，任何生物材料在進入臨床應用前應確保其不引起機體正常行使功能，經本實驗證實納米雙相磷酸鈣陶瓷與人體血液混合時幾乎不引起溶血反應（溶血率＜5%）。體外凝血試驗

結果發現：納米雙相磷酸鈣陶瓷與血漿結合后PT、TT、APTT、FIB 4項凝血功能指標均在正常范圍內，

提示其不影響機體凝血功能。急性全身毒性試驗是指24 h內一次或多次大劑量給予機體后造成機體全身代謝的毒性反應，實驗未見小鼠出現嚴重不良反應或死亡。體溫未見明顯升高，因此不具熱原性。單純從實驗結果來看，4項實驗結果一致，均表明納米雙相磷酸鈣陶瓷是一種有良好血液相容性及組織相容性的生物材料。

肌內埋植試驗是一種觀察鈣磷陶瓷材料與軟組織相容性的有效方法。一般認為HA陶瓷降解性能差[9]，其年降解率為5%～15%[10]；而β-TCP屬于快速降解陶瓷，其溶解度約比HA高10～20倍，其生物降解性能較好，可以通過體液溶解后細胞吞噬過程逐漸被機體完全吸收，由代謝系統排出體外。但骨傳導活性不如HA，植入體內后成骨能力不穩定[11]，因此有學者[12]選擇將其用于關節軟骨的修復。通過孔隙率和

組成相含量的控制，可改變磷酸鈣陶瓷在體內的降解速率。大量動物實驗證明鈣磷陶瓷具有良好的成骨性能和降解性能[13-14]。鈣磷陶瓷在體內的生物吸收

通常有2種方式，即體液的侵蝕溶解與細胞的吞噬誘導作用，主要發生的細胞學反應為巨噬細胞的吞噬作用及破骨細胞的溶解作用，對于直徑過大的材料顆粒或過于致密的材料部分，巨噬細胞則選擇細胞外降解，通過緊密貼附形成細胞-材料接觸區，局部釋放溶酶體和分泌Ｈ+，使接觸區降解；破骨細胞則通過碳酸脫氫酶產生Ｈ+降解材料。Webster等[15]將破骨

樣細胞接種于普通HA陶瓷上，發現納米HA材料組的抗酒石酸酸性磷酸酶合成量明顯大于對照組，并且破骨樣細胞在納米HA陶瓷材料上的吸收凹陷也明顯大于普通HA陶瓷材料。Webster等[16]分析認為納米雙相磷酸鈣陶瓷能選擇性吸附大量的玻璃體結合蛋白，所以較HA陶瓷能更多黏附破骨細胞。此外，破骨細

胞合成的磷酸鈣陶瓷缺乏細胞結合天然位點，其表面的可濕性、F電勢效應及游離的磷酸根離子影響了細胞吸附和增殖分化。納米陶瓷材料具有小尺寸效應和界面效應，可顯著增加細胞親和性，提高HA晶體的溶解性。在本實驗中，NanoBCP植入SD大鼠后其孔隙很快被纖維組織充滿，2周時可見有輕微的炎癥反應，主要是由于手術創傷引起；4周時組織切片顯示無炎癥反應，纖維組織生長好，提示材料有良好的組織相容性；12周時個別區域出現輕度炎細胞浸潤，異物吞噬反應及多核巨細胞較明顯，推測與材料部分崩解引起細胞免疫反應有關。實驗發現12周及24周時可見異物吞噬反應及多核巨細胞，這是由

于HA晶體溶解的碎片能夠激活巨噬細胞，進而引起炎性激肽物質如血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子等的釋放，從而影響成纖維細胞的行為，導致新生纖維組織的形成[17]。有報道顯示一定比例

的雙相磷酸鈣陶瓷在肌內植入后可誘導新骨形成，本實驗未觀察到此現象[18]。

對NanoBCP生物相容性的初步研究發現，其組織、血液相容性及生物安全性好。為使其應用于組織工程支架后降解速度與新骨形成達成協調一致，確定最適HA/β-TCP比率仍是一個重要的課題，尚有待于學者們進一步探索。

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（本文編輯 杜冰）