電子基因微芯片在醫學研究中的應用

郭育奇，趙春燕

·綜述·

電子基因微芯片在醫學研究中的應用

郭育奇，趙春燕

基因芯片（DNA microchip）也稱 DNA 微陣列（DNA microarray），是把大量基因探針或基因片段按特定的排列方式固定在芯片載體上，形成致密有序的 DNA 分子點陣，按堿基互補配對原則與樣品 DNA 雜交，然后通過計算機進行解讀和分析獲取大量信息，實現對生物樣品高效、平行地檢測或醫學診斷。由于具有高通量、快捷、便宜等優點，基因芯片在各個領域起著越來越重要的作用。芯片可以根據探針的性質、固體表面的支撐物、探針尋址或目標檢測方法的不同分為原位合成寡核苷酸微陣列（situ-synthesized oligonucleotide microarray）、高密度微珠陣列（high-density bead arrays）、電子微芯片（electronic microarrays）等。近年來，電子微芯片技術的發展越來越引起人們的關注，它是利用電場、熱循環或化學方法等吸引帶負電的 DNA 或其他生物分子和探針結合到芯片特定位點上從而進行主動雜交檢測[1]。該種芯片在精確性、準確性和嚴格性控制方面優于傳統芯片，可用于病原生物的檢測和鑒定、微生物的分型、基因表達分析、基因突變及多態性分析、疾病診斷和預測等。本文就電子基因芯片的工作原理、優勢和在醫學方面的應用作簡要綜述。

1　電子基因芯片的工作原理和操作流程

電子基因芯片的工作原理如圖 1 所示，它可借助電子場加快帶電的生物分子結合到芯片上的速度。芯片上的每一個位點代表了一個電極，每一個電極都可被分別通電。通電后產生的電場可加速帶負電的 DNA 探針或其他生物分子的結合。電子場一方面吸引特異性的寡核苷酸探針到特定位點，另一方面捕獲目的 DNA 并特異性雜交到寡聚探針上。芯片載體上建有電極矩陣，其上的每一個位點都有一個獨立的金屬線接頭。該矩陣通過標準的硅平版印刷術被組合在一起，并用 CMOS 片包埋，CMOS 片上的每個電極可被電壓和電流單獨控制。整個矩陣被包埋入一個一次性流體式的芯片中，這樣便可提供一個樣品或試劑的自動控制。電極矩陣上覆蓋了一層 1 ～ 2 μm 厚的水凝膠滲透層，該層含有親合素，親合素促使探針或目的基因被直接捕獲。在矩陣操作過程中，高電位促使水在陽極發生氧化反應，陰極發生還原反應。水的氧化反應產物是 H+和氧。這項技術就是利用陽極產生的 H+進行高效率的 DNA 雜交。反過來，如果陰極被激活產生 OH–，這樣帶負電的 DNA 分子就遠離電極。因此，這種電子式的嚴格性可識別出單個堿基的不同，因而可用來分析單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）[2-3]。

Nanogen 公司生產的 Nanochip 檢測系統包括 3 個部分：微電子芯片、上樣系統和檢測系統。微電子芯片是由 100 或 400 個位點組成，通過連接器來控制。通過對位點微電極的電位控制，在微電極的上方完成探針分子的選擇性固定，靶核酸定向轉移集中并與探針主動雜交。上樣系統是通過電場作用將探針或其他分子錨定到微電子芯片上，錨定完成之后對非特異性結合的物質進行洗滌，減少干擾反應。檢測系統用來檢測雜交后熒光信號的強度。運用互補金屬氧化半導體技術來進行核酸的電子尋址，如果探針和目的 DNA之間發生了特異性雜交反應，電子芯片被掃描后將呈現陽性結果[3-4]。

圖1　電子基因芯片的工作原理圖

2　電子基因芯片的優勢

與傳統的基因芯片相比，Nanochip 電子基因芯片具有如下幾點獨特性：①Nanochip 系統利用電子場和熱循環技術，達到了精確性、準確性和嚴格性的控制。②在芯片上，通過對電位的控制來移動和濃縮 DNA，對生物分子的電子吸引力大大加速了分子結合到芯片上的速度，與傳統的被動式芯片（如 Affymetrix，Genechip）相比，增加了 1000 倍以上。被動式芯片的點樣需要花幾個小時，而主動式電子芯片僅需要 30 ～ 60 s。因而，這種高效性可使 Nanochip 檢測極低濃度的靶基因。③多重性分析：電子式芯片提供了一個靈活的平臺。例如，在同一個芯片上可同時檢測一個樣品的多個基因，或一個基因的多個樣品，或多個樣品的多個基因。相反，傳統 DNA 芯片上的位點不能被分別控制，因此，只能檢測一個樣品的多個基因。該系統還配有晶載內存，用于儲存遺傳分析和檢測傳染病病原體的關鍵信息，為多路的檢測運轉提供了更高的通量。以最小的消耗來檢測多樣的目標產物。④電子式嚴格性：可識別單一堿基的不同，并可確定單核苷酸多態性。⑤結構開放性：允許實驗用戶定義、選擇和建立個性化的測試面板或從預先設定好的分析物特效試劑（analyte specific reagents，ASRs）中選擇。⑥性價比高：該系統簡化了工作流程，縮短了手動操作的時間。將開發和檢測突變的功能集中在一張芯片上，比傳統的芯片性價比高[2, 5-6]。

3　電子基因芯片在醫學中的應用

3.1微生物的檢測和鑒定

在臨床微生物學研究中，通過中低密度的電子基因微芯片對微生物的目標遺傳序列進行評價是非常重要的。檢測中最常用的靶基因是細菌中的 16S rRNA、真菌中的 28S rRNA 和 rRNA 基因間的轉錄間隔區[7]。在芯片檢測前需對樣本用寬范圍 PCR 或多重 PCR 處理，該措施可有效地提高靈敏度。在基因多樣性的篩選中，微芯片的平行性也高于其他篩選方法。對于細菌中的分枝桿菌屬可將 gyrB、rpoB 和 katG 基因作為目標基因。Sanguinetti 等[8]用 Nanochip電子微陣列來鑒定臨床相關分枝桿菌的種屬。先將臨床菌株進行分離培養，然后用 PCR 方法擴增分枝桿菌的 rRNA基因，最后將產物和種屬選擇性的探針進行雜交。結果證明該方法比傳統的鑒定方法更加快速、精確。

電子基因芯片結合寬范圍的 PCR 技術還可用于檢測和鑒定真菌、寄生蟲和病毒病原體。Takahashi 等[9]對流感病毒 A 和 B，呼吸道合胞病毒，副流感病毒 1，2，3 型進行檢測。比較了 Nanochip 400 系統和直接熒光抗體染色法（direct fluorescent-antibody staining，DFA）兩種方法檢測 122 份標本的結果，兩者一致性達到 86.9％。若把 DFA作為檢測的金標準，Nanochip 400 系統的靈敏度和特異度分別為 84.6％ 和 100％。差異分析表明 Nanochip 400 系統靈敏度和特異度可達 98.6％ 和 100％。同時還比較了Nanochip 400 系統和實時定量 PCR（real-time PCR）兩種方法檢測 130 份標本的結果，兩者的一致性為 93.9％。在差異分析中，Nanochip 400 系統敏感性和特異性分別為98.6％ 和 100％，而且 Nanochip 400 系統檢測過程在 4 h內即可完成。由此可見 Nanochip 系統檢測法是一種簡便、快速、靈敏的檢測常見呼吸道病毒的方法。

除此之外，該芯片還可以用于檢測環境中的有害微生物，防止因有害微生物大量繁殖造成的疾病或生態災難。Barlaan 等[10]對有害藻類大量繁殖過程（harmful algal blooms，HABs）中的細菌聚集物進行研究。通過變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）對 16S rRNA 基因進行分析。而后設計并合成特異的Nanochip微陣列的探針，通過雜交反應檢測物種。該方法可檢測 HABs 的發生和相對豐度，并可找出與 HABs 發生相關的核酸序列，該研究表明電子微陣列可檢測和監控環境中的微生物。

3.2微生物的分型

利用電子基因芯片對不同種類基因組做檢測可對微生物進行分型。該技術能克服傳統分型方法的許多限制，與遺傳學方法相結合后可補充或取代傳統的血清型方法。該技術現已用于病原體及其繁殖，患者的再感染與復發，患者的院內感染以及抗藥性菌株傳播等方面的研究。

Saunders 等[11]通過膜蛋白基因 V1 區對人類免疫缺陷病毒 1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）進行分型。通過對樣品進行巢式反轉錄 PCR，將擴增產物與 Nanochip 微陣列相連后與寡核苷酸探針雜交，根據探針雜交的模式對病毒株分型。文中將該方法與測序方法或異源雙鏈遷移率分析法（heteroduplex mobility assay，HMA）比較，不但準確性可與后兩種方法相媲美，并且是一種方便和高效的 HIV-1 分型方法。

在雷特綜合征患者中，女性 X 染色體相偶聯的MeCP2 基因中的 8 個點突變占了正向突變總數的 70％。Thistlethwaite 等[12]以 Nanogen 系統為基礎開發出了一種新的方法來檢測這 8 個突變。然后將結果與變性高效液相色譜和測序方法結果進行比較。結果表明該分型技術表現出100％ 的特異性和 3％ 的多義性。在特異性和精確性方面，該方法與單引物擴增反應在同一水平，并且更快更經濟。

3.3基因的差異表達分析

微芯片技術顯著地增強了對基因差異表達的檢測能力。與傳統的微芯片相比，電子基因芯片能更快、更精確地分析不同組織中基因表達的變化。通過檢測基因的差異表達，從而研究特殊基因與疾病之間關系。對疾病的診斷和治療有重要意義。Corradi 等[13]應用該芯片對人白血病相關的融合基因進行研究。特定基因的表達量、基因多態性分布等生物學特征，在危險分層、靶向治療或檢測微量殘存疾病的標記等方面有重要作用。作者將多重 RT-PCR、電雜交技術與Nanochip 系統相結合，對人普通的白血病轉錄融合基因進行篩選。實驗證明該方法是高效的基因表達分析方法。

3.4基因突變檢測和多態性分析

研究表明大多數疾病是由多個核苷酸突變引起的，因此研究這些核苷酸突變能獲取有價值的醫學信息。在臨床診斷中，單核苷酸多態性可作為識別疾病基因的遺傳標志，它既可用于分析病人與對照組之間的相關性又可解釋同種微生物之間的接合作用。通過 SNP 分析可繪制和診斷疾病相關的等位基因。電子微陣列技術簡單、快速、自動化程度高，可用來篩選和檢測大量相關的 SNP，從而確定特殊微生物的 SNP 和應答病原體毒素的 SNP。

Evans 等[14]建立了一種以 Nanochip 系統為基礎的新方法來檢測凝血因子 V Leiden（factor V Leiden，FVL）中點突變，而后將該方法得出的結果與 Third Wave 分析法得出結果進行比較。Nanochip 系統在野生型，雜合子和純合子特征化的精確度均為 100％，而 Third Wave 分析的精確度為 99.2％，90.2％ 和 100％，前者顯然優于后者。同樣可對家族性地中海熱（familial Mediterranean fever，FMF）中FMF（MEFV），factor V（F5）和 factor II（F2）基因型進行鑒定，并做突變和 SNP 分析。結果證明新方法是一種自動化、高通量的 SNP 檢測方法[15]。

在兒童急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）人中，硫嘌呤甲基轉移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）活性、基因型對 6-硫嘌呤（6-mercaptopurine，6-MP）化療個體化有重要意義。Albayrak 等[16]以患 ALL 病的土耳其兒童為研究對象，應用 Nanochip 技術對患者的遺傳多態性進行檢測，探究多態性與個體低 TPMT 活性和耐受 6-MP 突變體之間的關系。檢測結果表明患者 TPMT 多態性頻率和分布與其他白種人相似，而 6-MP 毒性過大導致突變體的產生，所以對TPMT 基因的分型須在用 6-MP 治療之前完成。

在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）和彌散性支氣管擴張（disseminated bronchiectasis，DB）患者中，Papatheodorou等[17]對 TNF-α基因啟動子的多態性與基因的轉錄活性的關系進行研究，運用 Nanochip 系統對 5 個啟動子的 SNP 進行分析。結果顯示在 COPD 組、DB 組和健康吸煙者組三者之間 5 個SNP 的基因型頻率沒有顯著性差異。僅 COPD 患者組的單倍體頻率（haplotype frequencies）與普通人組之間出現了差異。在確定遺傳風險度研究中，作者對 SERPINA1、2 和ADRB2 基因中的 5 個 SNP 進行分型。結果表明SERPINA1 中 p.V213A 的多態性與 DB 的風險有關。ADRB2 的 p.G16R 是嚴重 COPD 風險因素[18]。

3.5其他方面

除此之外，Weigum 等[19]開發出了一種新型的 BNC 傳感技術（bio-nanochip sensor technique），并用此技術檢測脫屑性細胞學（exfoliative cytology）樣品中的口腔癌細胞和生物標記物（oral cancer biomarkers）。通過對 41 例牙科患者和 11 例正常人的樣品的表皮細胞和表皮生長因子受體（EGFR）進行檢測和分析，包括細胞核直徑和面積、細胞核和細胞質（N/C）比例、生物標記的表達量。結果發現幾乎所有細胞的這 4 項關鍵的參數都得到明顯的提高。將檢測的一系列特征結果進行綜合分析，能特異性地提高對口腔癌及癌變前的狀態的辨別力度。

在卵巢癌的早期診斷方面，Raamanathan 等[20]應用程序化的生物納米芯片（programmable bio-nano-chip）平臺對樣品中的生物標記物進行檢測。該技術可在 45 min內對血清中 CA125 做定量檢測和分析。該系統在卵巢癌診斷過程中有非常好的應用前景。

4　電子基因微芯片前景展望

電子基因芯片發展到現在不足十年的時間，通過它，人類顯著地提高了認識生命本質的能力，為研究生命這個復雜的網絡系統打下基礎[21]。現在各國的研究機構都在對此進行積極的研究，電子基因芯片在基因表達譜分析、病原生物鑒定、基因分型、突變檢測及單核苷酸多態性分析等方面都已呈現出廣闊的應用前景。雖然電子基因芯片技術還存在問題，但隨著新技術和新思想的不斷產生，電子基因芯片的發展與完善將對醫學研究與應用產生深遠的影響[22]。

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DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.010

基金項目：吉林省衛生廳項目（2008Z001）

作者單位：130021 長春，吉林大學白求恩醫學院病原生物學系

通訊作者：趙春燕，Email：chunyanzhao44@yahoo.com

收稿日期：2012-03-16