抗菌藥物新靶位

陳盈盈，張玉彬，顧覺奮

·綜述·

抗菌藥物新靶位

陳盈盈，張玉彬，顧覺奮

近年來，由于過度使用抗生素，特別是濫用抗生素，病原菌日益廣泛的耐藥性已成為藥物治療中越來越常見的問題[1]。為了克服細菌的耐藥性，特別是多重耐藥性問題，人們需要運用新的思路去發掘新的抗生素，因此，探索新型抗菌機制已成為目前的迫切需要。本文綜述了近幾年發現的抗菌藥物的新靶位，分別從作用于細菌（真菌）細胞壁、細胞膜、RNA 聚合酶、胞內代謝及調控等 4 方面來談抗菌藥物的新作用靶位。

1　細胞壁

肽聚糖（peptidoglycan）是構成細菌細胞壁的主要成分，革蘭陽性和陰性細菌中都含有肽聚糖結構，因此肽聚糖的生物合成途徑成為開發廣譜抗菌藥物的研究熱點。

D-丙氨酸是細菌細胞壁中肽聚糖結構的組成成分，主要存在于二肽 D-丙氨酰-D-丙氨酸中，D-丙氨酸直接參與相鄰肽聚糖鏈的交聯。在原核生物中，D-丙氨酸的主要合成途徑是通過丙氨酸消旋酶（Alr）催化 L-丙氨酸轉化而來[2]。

催化肽聚糖合成的胞漿步驟的酶包括烯醇丙酮轉移酶MurA、黃素依賴還原酶 MurB 和 ATP 依賴的連接酶MurC、MurD、MurE 和 MurF，通過這些酶的作用，為UDPMurNAc 乙?；鶄孺溙砑?L-丙氨酸、D-谷氨酸、內消旋二氨基庚二酸（M-DAP）或 L-賴氨酸、D-丙氨酸-D-丙氨酸二肽，生成 UDPMurNAc-五肽，之后移位酶 MraY 和糖基轉移酶 MurG 催化 UDPMurNAc-五肽轉化為脂質中間體 I 和 II。

某些革蘭陽性菌酶，如金黃色葡萄球菌 FemABX 酶以甘氨酰-tRNA 為底物，增加 5個甘氨酸殘基，參與肽交聯；肺炎鏈球菌 MurM 和 MurN 連接酶分別向脂質中間體 II添加 Ala/Ser 和 Ala。雖然這些酶不是廣譜抗菌的靶位，但這些酶的抑制劑可能用于與青霉素協同治療耐青霉素病原體。

李冬和李卓榮[3]報道，5-氨基-呋喃糖苷衍生物大多有抗分枝桿菌的活性，也可以有效抑制丙氨酸消旋酶，其最低抑菌濃度為 3112 μg/ml。Sova 等[4]發現 1-（4-甲氧苯基磺酰氨基-）3-嗎啉丙烷-2-磷酸二氫（圖 1），是目前為止最好的MurE 連接酶抑制劑，其 IC50為 6 μmol/L。其他作用于肽聚糖生物合成途徑的靶點及其抑制劑如表 1 所示。

2　細胞膜

細菌中 FASII 系統的單功能酶已成為基因組驅動的新型抗菌藥物靶標研究的熱點[5]。以大腸桿菌為例，細菌脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthesis，Fab）的途徑如圖 2 所示。FabH 和 FabI 與相應的人類酶相比，缺乏總的序列的同源性，因此成為抗菌藥物極好的靶位[6]。

圖1　1-(4-甲氧苯基磺酰氨基)-3-嗎啉丙烷-2-磷酸二氫

表1　肽聚糖生物合成酶抑制劑的效力（IC50）和抗菌活性（MIC）

FabH 介導乙酰輔酶 A 和丙二酰 ACP 縮合形成β-酮酰基-ACP，是催化脂肪酸合成碳鏈延長循環的起始因子，這一調控步驟在確定 FASII 途徑產生的脂肪酸量也起到了關鍵作用。FabI 是細菌脂肪酸生物合成中必需的酶，其催化反式-2-烯酰-ACP 還原為?；?ACP，為延伸循環的最后步驟，也是限速步驟。

張學輝等[7]報道了關于 FabH 的相關抑制劑。Wen 等[8]從 46 種新合成的 1,6 二取代吲哚 2-羧酸類似物中篩選得到 WIUAKP-001，對 FT-FabH 酶抑制的 IC50為 2 μmol/L，WIUAKP-031 和 WIUAKP-056 對 FT-FabI 酶抑制活性的IC50分別為 6 μmol/L 和 7 μmol/L（表 2）。

3　RNA 聚合酶

細菌的 RNA 聚合酶（RNAP）內轉化區是一個新發現的藥物靶標，作用于此靶位的酶抑制劑不存在和其他抗菌藥物交叉耐藥的現象。

轉換區是一個結構元件，在轉錄起始階段，DNA 加載到 RNA 聚合酶活躍的中心裂縫時，介導 RNA 聚合酶構象的變化[9-11]（圖 3）。轉化區位于 RNA 聚合酶鉗夾的底部，是鉸鏈調節 RNA 聚合酶的開關。當 DNA 要加載到RNA 聚合酶活躍的中心裂縫時，鉗夾打開，當 DNA 停留在 RNA 聚合酶裂縫中心時，鉗夾關閉。轉換區共有 5 部分，分別被稱為“轉換 1”到“轉換 5”，它們局部構象的改變可以調控鉗夾的開啟和閉合（圖 3B）[12]。在 RNA 聚合酶裂縫中心，轉換 1、2、3 可以直接接觸已展開的 DNA模板鏈[13]。

4 個和轉換區結合的天然產物已被確定，均具有抑制細菌 RNA 聚合酶活性，并表現出廣譜抗菌活性，它們分別是：myxopyronin（Myx）、corallopyronin（Cor）、ripostatin（Rip）和 lipiarmycin（Lpm）（表 3）[14]。根據 Myx/Cor/Rip 作用靶位，目前已篩選出 3 種新型的結構不相關的 RNA 聚合酶抑制劑。

4　胞內調控作用

圖2　大腸桿菌脂肪酸的生物合成途徑

表2　酶抑制劑 WIUAKP-001、WIUAKP-031 和 WIUAKP-056 的結構和作用靶位

大多原核生物采用一種類似的機制—“雙組分系統”調控蛋白質磷酸化，進行信號轉導。迄今為止，此種機制尚未在高等真核生物體內發現?！半p組分系統”的核心通常由兩個蛋白組成。一是組氨酸蛋白激酶（HK）。通常它是一個跨膜蛋白，結構可分為 3 部分，自 N 端到 C 端依次為配體（信號）結合部位，為高度可變區；組氨酸自身磷酸化位點，分子構象為二聚體；ATP 結合的激酶功能區，內含 N、G1、F、G2 等 4 個保守的基序（motif）。另一個蛋白為反應調節蛋白（RR），是一個胞質蛋白。結構上分為兩部分，N 端含有能接受磷酸基團的天冬氨酸位點，相對保守，為調控區域；C 端為效應區，序列高度可變，含有多個可與不同的 DNA 序列特異性結合的位點。

圖3　RNA 聚合酶夾子和 RNA 聚合酶轉化區[A：RNA 聚合酶鉗夾的構象狀態（兩個正交視圖）[12]。RNA 聚合酶結構呈現出開放（黑色），半封閉（淺灰色），并完全封閉（灰色）構象。實線圈代表轉換區，虛線圈為利福霉素的結合位點，實線圈與虛線圈之間的黑點為 Mg2+的活性中心；B：RNA 聚合酶轉化區構象的立體視圖。RNA 聚合酶轉換 1 和轉換 2 的結構開放（黑色），半封閉（淺灰色），全封閉（灰色）鉗夾構象?；疑綁K為轉換 1 和轉換 2 與 RNA 聚合酶主體的連接點。黑、淺灰、灰色圓圈分別表示轉換 1 和轉換 2 與 RNA 聚合酶鉗夾的連接點]

表3　作用在 RNA 聚合酶轉換區的 RNA 聚合酶抑制劑的活性

圖4　幾種蛋白激酶抑制劑的化學結構

當外界信號作用于組氨酸蛋白激酶的膜外配體結合區時，激活了激酶的 ATP 結合部位、水解 ATP 為 ADP，并將 ATP 的磷酸基團轉移到激酶上的組氨酸位點，使其發生自身磷酸化。隨后，反應調節蛋白的調控區域能與磷酸化的組氨酸蛋白激酶相互作用，將激酶上的磷酸基團轉移到自身的天冬氨酸位點上，發生自身磷酸化，并能激活效應區，使其構象改變，暴露不同的 DNA 結合位點，結合不同的DNA 序列，產生一系列的調控反應。針對作用在組氨酸激酶的作用靶點，歸納近幾年其有效的抑制劑如圖 4 和表 4所示。

表4　幾種蛋白激酶的作用機制及其抑制劑

5　結論

細菌的耐藥性及交叉耐藥性日益嚴重，尋找新型作用機制的抗菌藥物，發現新作用靶點及其有效的抑制劑是今后抗生素藥物發展的一個重要方向。如上介紹了 4 種類型的作用靶位及其靶酶抑制劑，這些潛在藥物目前大多仍處于對先導物優化的起始研究階段，但人們對這些針對細菌耐藥性的新思路及其發展前景充滿信心。通過研究抗菌藥物新靶位，推出新的高效抗菌藥物，將為人類重大疾病提供突破性治療。

參考文獻

[1] Alekshun MN, Levy SB. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell, 2007, 128(6):1037-1050.

[2] Chacon O, Bermudez LE, Zinniel DK, et al. Impairment of D-alanine biosynthesis in Mycobacterium smegmatis determines decreased intracellular survival in human macrophages. Microbiology, 2009, 155(Pt 5):1440-1450.

[3] Li D, Li ZR. Progress in the research of antituberculous drugs (I). Chin J New Drugs, 2009, 18(1):35-42. (in Chinese)李冬, 李卓榮. 抗結核藥物的研究進展（一）. 中國新藥雜志, 2009, 18(1):35-42.

[4] Sova M, Kovac A, Turk S, et al. Phosphorylated hydroxyethylamines as novel inhibitors of the bacterial cell wall biosynthesis enzymes MurC to MurF. Bioorg Chem, 2009, 37(6):217-222.

[5] Zhang YM, White SW, Rock CO. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. J Biol Chem, 2006, 281(26):17541-17544.

[6] Lu H, Tonge PJ. Inhibitors of FabI, an enzyme drug target in the bacterial fatty acid biosynthesis pathway. Acc Chem Res, 2008, 41(1):11-20.

[7] Zhang XH, Yu H, Wang LL, et al. Progress in the research of antibacterial drugs new target FabH and its inhibitors. Foreign Med Sci (Section Pharm), 2006, 33(4):262-265. (in Chinese)張學輝, 于紅, 王莉莉, 等. 抗菌藥物新靶標FabH及其抑制劑研究進展. 國外醫學藥學分冊, 2006, 33(4):262-265.

[8] Wen L, Chmielowski JN, Bohn KC, et al. Functional expression of Francisella tularensis FabH and FabI, potential antibacterial targets. Protein Expr Purifi, 2009, 65(1):83-91.

[9] Belogurov GA, Vassylyeva MN, Sevostyanova A, et al. Transcription inactivation through local refolding of the RNA polymerase structure. Nature, 2009, 457(7227):332-335.

[10] Tupin A, Gualtieri M, Brodolin K, et al. Myxopyronin: a punch in the jaws of bacterial RNA polymerase. Future Microbiol, 2009, 4(2): 145-149.

[11] Haebich D, von Nussbaum F. Lost in transcription--inhibition of RNA polymerase. Angew Chem Int Ed Engl, 2009, 48(19):3397-3400.

[12] Mukhopadhyay J, Das K, Ismail S, et al. The RNA polymerase “switch region” is a target for inhibitors. Cell, 2008, 135(2):295-307.

[13] Vassylyev DG, Vassylyeva MN, Perederina A, et al. Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase. Nature, 2007, 448(7150):157-162.

[14] Tupin A, Gualtieri M, Leonetti JP, et al. The transcription inhibitor lipiarmycin blocks DNA fitting into the RNA polymerase catalytic site. EMBO J, 2010, 29(15):2527-2537.

[15] Gilmour R, Foster JE, Sheng Q, et al. New class of competitive inhibitor of bacterial histidine kinases. J Bacteriol, 2005, 187(23): 8196-8200.

[16] Qin Z, Zhang J, Xu B, et al. Structure-based discovery of inhibitors of the YycG histidine kinase: new chemical leads to combat Staphylococcus epidermidis infections. BMC Microbiol, 2006, 6:96.

[17] Kitayama T, Iwabuchi R, Minagawa S, et al. Synthesis of a novel inhibitor against MRSA and VRE: preparation from zerumbone ring opening material showing histidine-kinase inhibition. Bioorg Med Chem Lett, 2007, 17(4):1098-1101.

[18] Wehenkel A, Fernandez P, Bellinzoni M, et al. The structure of PknB in complex with mitoxantrone, an ATP-competitive inhibitor, suggests amode of protein kinase regulation inmycobacteria. FEBS Lett, 2006, 580(13):3018-3022.

[19] Székely R, Wáczek F, Szabadkai I, et al. A novel drug discovery concept for tuberculosis: inhibition of bacterial and host cell signaling. Immunol Lett, 2008, 116(2):225-231.

[20] Oxoby M, Moreau F, Durant L, et al. Towards Gram-positive antivirulence drugs: new inhibitors of Streptococcus agalactiae Stk1. Bioorg Med Chem Lett, 2010, 20(12):3486-3490.

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.011

作者單位：210009 南京，中國藥科大學生命科學與技術學院

通訊作者：顧覺奮，Email：yqyan1@126.com

收稿日期：2012-03-05