肝癌組織血管內皮生長因子與受體的表達及其臨床意義

周 輝，牟洪超，孫 茂，董立軍

在肝癌的治療中，手術切除被認為是首選的方法，雖然術后配合介入治療、微波治療、射頻消融、生物免疫療法等，但肝癌的病死率仍然很高，術后轉移和復發是影響患者術后長期生存的首要原因。大量研究表明腫瘤血管生成是惡性腫瘤生長、浸潤和轉移的重要病理基礎[1]，而血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 是血管形成的關鍵因子，VEGF通過與血管內皮生長因子受 體 （vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）結合后使受體磷酸化激活細胞內信號傳導通路而實現促血管形成效用。肝癌組織中癌細胞依靠豐富的新生血管網快速生長，并通過血管網在肝內發生侵襲和轉移。近年許多研究已發現VEGF在肝癌組織中廣泛表達，促進血管形成，促進肝癌復發轉移[2]。本文通過免疫組化檢測肝癌手術切除標本VEGF及VEGFR，分析它們與肝癌的臨床病理特征及術后生存率的聯系，以了解它們對肝癌術后復發、轉移的影響及評估預后，為預防肝癌術后復發、轉移及提高術后生存率提供更多方法。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本組76例為在筆者所在醫院肝膽外科2004-03～2007-12住院的手術患者，均為首次手術，術后病理證實為原發性肝細胞癌，術前未行放、化療或介入治療，術后均依據不同病情行1~2次介入治療，術后至少隨訪2年以上，開始2年內1~3個月隨訪1次，以后6~12個月隨訪1次，最長已隨訪5年，生存時間從手術之日起開始計算。男59例，女17例；年齡34~61歲，平均48.7歲。有乙肝病史者69例，丙肝病史者3例，無肝炎者4例；合并不同程度肝硬化64例，無明顯肝硬化12例；術前肝功能均為Child-A級；術前AFP>400 ng/L 59例，AFP≤400 ng/L 17例；增強CT掃描檢查發現腫塊位于肝右葉43例，左葉27例，左內與右前葉交界部位4例，尾狀葉2例；腫塊單發69例，有2~3個病灶者7例 (6例為局限于1葉或1段內，1例為右后葉及左外葉各1個病灶)；有門靜脈轉移者9例，形成膽管癌栓者3例，術后病理證實伴肝段或肝葉內微小灶轉移灶者12例，所有76例術前檢查均排除遠隔轉移；腫塊直徑>5 cm者61例，≤5 cm者15例；腫瘤界限清楚存在假包膜者41例，界限不清無明顯包膜或包膜不完整35例；術后病理檢查高分化19例、中分化36例、低分化21例。

1.2 免疫組化染色 VEGF、VEGFR測定：選取肝癌手術標本中無壞死的部分以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋。組織蠟塊切片、脫蠟，免疫組化法試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司），嚴格按試劑盒操作流程說明進行操作。鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人VEGFR單克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒、二抗試劑盒均為北京中杉金橋生物技術公司產品，采用免疫組化SP法做VEGF和VEGFR兩種免疫組化檢測，VEGF和VEGFR工作濃度均為1∶50，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.3 結果判定 VEGF表達主要見于腫瘤細胞漿中，為胞漿內棕黃色粗大顆粒，部分胞膜也有表達，間質細胞及血管內皮細胞表達較少；VEGFR主要在血管內皮細胞表達，而肝癌細胞漿呈弱陽性表達。參照文獻運用高倍鏡（@200）于染色密集區每片隨機計數3個視野，每視野計分為陽性細胞染色強度和陽性細胞率的得分之和：無染色0分，弱染色（淺黃）1分，中等染色（棕黃）2分，強染色（棕褐色）3分；陽性細胞率<5%計0分，5%~25%計1分，26~50%計2分，>50%計3分。各視野得分的平均值作為最終得分：0分為陰性，1~2分為弱陽性，3~4分為中度陽性，5~6分為強陽性，并把陰性和弱陽性合并作為陰性結果，而中陽性及強陽性合并作為陽性結果[3]。本組76例中無陰性表達，故將弱陽性作為陰性統計。

1.4 統計學分析 采用SPSS11.5統計分析軟件處理數據。壽命表法計算無瘤生存率，單因素生存時間對比分析采用對數秩和檢驗，計量資料采用t檢驗，計數資料及兩因素相關采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 肝癌患者手術2年后無瘤生存率 全部76例術后隨訪2年以上，無失訪者，術后1年有29例復發，術后2年復發19例，按壽命表法計算術后第1、2年累計平均無瘤生存率分別為61.85%±5.57%、40.97%±5.63%。

2.2 分析肝癌術后生存時間的影響因素 臨床中影響肝癌患者術后生存時間的因素很多，根據臨床實際情況主要分析年齡、性別、有無肝硬化、有無病毒性肝炎、術前AFP水平、術前肝癌在肝內是否轉移、腫塊大小、腫塊數目、腫塊包膜情況、腫瘤分化程度和VEGF、VEGFR的表達水平與術后生存時間的關系，先逐個做單因素分析對數秩和檢驗，經統計學分析發現性別、年齡、病毒性肝炎、肝硬化、術前AFP水平及腫瘤分化程度對術后生存時間影響無統計學差異；而VEGF、VEGFR陽性表達和術前肝內轉移情況、腫塊大小、腫塊數目、腫瘤有無假包膜對生存時間的影響有統計學差異（P<0.05）。

2.3 VEGF、VEGFR與轉移、腫塊體積、腫塊數目及腫瘤包膜之間的相互關系 將免疫組化染色的標本與已知陰性片對照比較，發現VEGF陽性表達61例，陽性率80.3%，VEGFR陽性表達67例，陽性率88.2%。對肝癌術后生存時間有明顯影響的六項指標中，肝癌體積大小、轉移情況、有無包膜與VEGF、VEGFR的陽性表達密切相關 （P<0.05）， 說明VEGF、VEGFR陽性表達者能促進血管快速形成，加速腫瘤生長，增加腫瘤的侵襲性，并促進轉移。

2.4 VEGF、VEGFR的表達與術后2年復發的關系將術后第1、2年后復發患者的VEGF、VEGFR表達的情況進行χ2檢驗，以了解之間的關系，經統計分析發現VEGF、VEGFR的陽性表達與術后復發密切相關（P<0.05），說明 VEGF、VEGFR 陽性表達者術后復發或轉移的可能性明顯增大，無瘤生存時間短。

2.5 VEGF、VEGFR表達的關系 將VEGF、VEGFR的表達情況進行相互比較分析，應用χ2檢驗發現VEGF、VEGFR的表達相互之間具有相關性 （P<0.05），說明在肝癌組織中VEGF、VEGFR二者之間的表達具有相互促進作用。

3 討 論

正常情況下，VEGF在人體內維持在一個較低水平，在生理需要的情況下，如胚胎形成、骨骼生長等時VEGF表達增加，促使血管快速形成，滿足機體的生長發育，但在病理狀態下，如腫瘤的形成過程中腫瘤細胞也表達大量的VEGF，形成血管網，以促進腫瘤的快速擴展和蔓延。這種情況在肝癌組織中表現的更加顯著，臨床及病理均已證實肝癌是一種富血管腫瘤，在肝癌組織中存在大量的腫瘤新生血管。大量資料表明VEGF是腫瘤血管形成的關鍵生長因子，在肝癌組織中呈現高表達，VEGF表達程度與肝癌組織內微血管密度一致，并在肝癌生長、侵襲和轉移過程中發揮重要的作用[4]。在本組76例中無陰性表達，VEGF呈陽性表達有61例，陽性率80.3%，比其它文獻結果略高[2，4]，估計可能與樣本選擇、樣本數大小、檢測方法、對照標準等不同有關，但結論還是一致。在本組肝癌組織中VEGF呈高表達，筆者推測VEGF陽性表達越強，腫瘤新生血管網越多，腫塊生長越快，本組61例陽性表達患者中有56例為直徑>5 cm者，筆者考慮這種VEGF高表達促血管生成及腫瘤生長的作用可能是腫瘤在快速生長過程中由于腫塊缺血缺氧誘導刺激癌細胞通過自分泌和旁分泌途徑表達大量VEGF的緣故，這與其它文獻報道相符[1，2]，其余15例統計為陰性者其實也呈現弱陽性表達，但大部分是直徑<5 cm的患者，術前影像學檢查即顯示為少血供腫瘤，這也從另一面說明了這一點。

原發性肝癌號稱為“癌腫之王”，主要是從肝癌的生物學行為角度說的，因肝癌惡性度高，侵襲性強，術后易于復發、轉移，因而長期生存率低。近年來對于肝癌復發的預測做了大量研究，有許多指標可以用于預測復發和生存時間，除了一些臨床及病理特征對肝癌術后復發及生存時間的影響可以作為預測項目外，VEGF作為預測指標正日漸得到臨床的認可[6]。本文資料顯示VEGF、VEGFR陽性表達和術前肝癌的肝內轉移情況、腫塊大小、腫塊數目、腫瘤有無包膜等因素對復發和生存時間的影響明顯，而腫瘤大小、轉移情況、有無假包膜等與VEGF、VEGFR的陽性表達相互之間也密切相關，說明VEGF、VEGFR高表達能促進血管快速形成，加速腫瘤生長，促進轉移，統計全組復發情況時發現術后2年內復發患者與VEGF、VEGFR的陽性表達緊密相聯，存在顯著的相關性，據此并結合其他文獻研究結果得出結論VEGF、VEGFR是影響肝癌發展方向的重要因素之一，可以作為術后預測復發的重要指標。

在腫瘤組織中VEGF、VEGFR是通過自分泌和（或）旁分泌途徑，聯合調控腫瘤組織血管內皮細胞分裂增殖和血管形成的，并且VEGF、VEGFR的表達相互關聯。VEGF和VEGFR類型雖多種多樣，但許多研究發現肝癌組織中VEGF的表達主要是VEGF165，主要分布于肝癌細胞漿內，VEGFR表達以VEGFR-2為主，主要分布在巨噬細胞和腫瘤血管的內皮細胞上，只有二者結合才能產生促血管形成、促進腫瘤復發轉移的效應[1，4]。通過本組76例肝癌標本的研究筆者發現VEGF的表達主要見于肝癌細胞漿中，免疫組化染色為胞漿內棕黃色粗大顆粒，部分胞膜也有表達，間質細胞及血管內皮細胞表達較少，而VEGFR主要在肝癌組織的血管內皮細胞表達，癌細胞漿僅呈弱陽性表達，并且在61例VEGF陽性患者與67例VEGFR陽性患者中，有56例同時呈陽性表達，因此筆者認為VEGF誘導的血管生成和腫瘤生長、復發轉移過程中與VEGFR在肝癌組織血管內皮細胞上的表達也是密切相關的。

總之肝癌的生長離不開持續和廣泛的血管生成，抑制新生血管可能成為治療肝癌的另一種有效的新方法。由于VEGF的表達與血管生成和肝癌細胞生長都密切相關，因而抑制和阻斷肝癌細胞所分泌的VEGF的生物活性對遏制肝癌生長和轉移，提高肝癌術后生存時間等方面有重要意義。

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