Bacillus thuringiensis營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3與其轉基因植物研究進展

張安紅，羅曉麗，肖娟麗，王志安，吳家和

（1.山西省農業(yè)科學院棉花研究所，山西運城044000；2.中國科學院微生物研究所，北京100101）

Btcry基因是從蘇云金芽孢桿菌中分離的編碼殺蟲晶體蛋白ICPs的基因，是目前研究最為深入、應用范圍最廣的一類殺蟲基因。這種殺蟲蛋白對鱗翅目昆蟲有毒殺活性。近20 a來，編碼這種殺蟲晶體蛋白的基因已經成功應用于植物基因工程，培育出多種轉基因抗蟲植物。其中，轉基因抗蟲棉花和抗蟲玉米在生產上得到大規(guī)模的商業(yè)應用，取得了巨大的經濟效益。雖然轉基因作物的種植與應用有效地控制了害蟲為害，但是，隨著種植面積的不斷擴大，尤其在沒有采取庇護所等防范措施下，害蟲對其產生抗性的幾率也越來越大。目前，有很多報道指出，害蟲對轉基因作物產生了不同程度的抗性[1-2]。當前在中國，大面積種植轉cry1A基因棉花，很好地控制了棉鈴蟲的危害，減少了農藥的使用。正因為如此，造成了以前不是棉花主要害蟲的大發(fā)生，如盲椿象、小菜蛾和粉紋夜蛾等。經過多年的種植，轉Btcry1A基因棉花對棉鈴蟲的抗性有所下降[3-4]。因此，開發(fā)和利用其他類型的殺蟲基因是當前十分迫切的要求。與ICPs相比，Vip是Bt營養(yǎng)期生長階段分泌的蛋白，它不形成晶體，在氨基酸序列上與ICPs沒有同源性，對鱗翅目、鞘翅目和同翅目等多種農林害蟲有殺蟲活性，是一類新型的殺蟲蛋白。Vips主要分為Vip1，Vip2和Vip3，在Vip3中已發(fā)現(xiàn)多個類型，其中，Vip3A蛋白是一種廣譜殺蟲蛋白，其對草地貪夜蛾（Spodoptra frugiperda）、甜菜夜蛾（Spoaoptera exigua）、煙蚜夜蛾（Heliothis virescens）等害蟲有較高的毒殺作用[5]。因此，Vip3蛋白作為新的殺蟲資源在研究和應用方面具有巨大的潛力。

1 Vip3的特性及其殺蟲活性

Vip3和Cry毒素在Bt中產生的時間不一樣，Vip3在Bt對數生長中期開始分泌，以可溶性蛋白形式分泌在培養(yǎng)基中，在Bt生長穩(wěn)定前期到達高峰，而且在產孢期和產孢后期均保持高分泌量；而Cry在Bt生長穩(wěn)定期開始分泌，在胞內形成晶體蛋白。Vip3和Cry毒素的物理特性也不一樣，Vip3具有熱不穩(wěn)定性，在90℃處理20 min時失活；而Cry毒素具有較好的熱穩(wěn)定性[5]。

Vip3的殺蟲譜和殺蟲活性與ICPs不同。Vip3A對鱗翅目害蟲具有廣譜的殺蟲活性，如對棉鈴蟲和甜菜夜蛾高毒，對秋黏蟲的毒性比Cry1Ab和Cry1Fa高，對煙蚜夜蛾、小菜蛾也具有高殺蟲活性[6-8]，殺蟲活性均達納克級水平。小地老虎對ICPs具有很強的抗性，但對Vip3A非常敏感；與Cry1A相比，Vip3A對小地老虎的毒性高出260多倍[5]，對粉紋夜蛾和煙蚜夜蛾也具有良好的殺蟲活性[9-10]。

2 Vip3的作用機理

Vip3殺蟲機理主要體現(xiàn)在毒素對昆蟲中腸細胞的破壞。組織病理學表明，小地老虎飼喂含Vip3A飼料24 h后，昆蟲的中腸上皮柱狀細胞末端膨大成球狀，杯狀細胞在形態(tài)上有所改變，但沒有受到明顯的損傷；48 h后，上皮柱狀細胞破裂，內腔充滿降解的細胞碎片，杯狀細胞受到明顯的損傷，但這2種細胞仍然與基膜相連接；72 h后，中腸上皮層完全脫落，小地老虎死亡。

Vip3與已知的ICPs沒有序列同源性和結構相似性。ICPs對昆蟲的毒殺作用主要是在昆蟲中腸的高pH條件下溶解殺蟲的晶體毒素，經過一系列蛋白酶作用，C-端部分氨基酸首先被切除，N-端28個氨基酸隨后也被切除，最終活性片段在cadherin類蛋白作用下形成聚合體，與中腸刷狀緣膜囊上的特異性受體相結合，在細胞膜上產生離子通道，引起細胞膜穿孔，細胞破裂，造成昆蟲生化代謝及生理功能失調，停止進食，最后死亡[11]。Vip3為可溶性蛋白，不需通過昆蟲中腸的消化即可直接起作用，Vip3以可溶形式進入昆蟲消化系統(tǒng)，到達中腸后經過一系列的蛋白酶作用，形成核心蛋白與中腸細胞結合，引起細胞膜穿孔，細胞破裂，造成昆蟲生化代謝及生理功能失調，停止進食，最后死亡[12]。

3 轉Vip3基因作物研究與應用

種植轉基因抗蟲作物是治理害蟲的一個有效途徑。目前，世界各地已有多個實驗室構建了含有不同Vip3基因的轉基因植物載體，并將其導入玉米、棉花和水稻等作物中[13]。Vip3新菌株、新殺蟲特性、新殺蟲蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)，為培育抗蟲轉基因植物提供了新的基因資源。

Estruch將培育出的轉Vip3Aa基因抗蟲玉米申請專利。他構建的T-DNA載體使用不同的啟動子（全株表達的泛素啟動子，在葉綠體中表達的PEPC啟動子，在根際表達的MTL啟動子）控制改造過的Vip3Aa基因（提高GC含量，使用玉米偏好密碼子）在玉米中進行表達。結果表明，這些啟動子控制下的轉Vip3Aa基因玉米對于多種玉米害蟲（如小地老虎、甜菜夜蛾、秋黏蟲和粉紋夜蛾）均有殺蟲活性[14]。先正達公司已成功地將Vip3A導入不同作物，得到高效抗蟲多價轉基因玉米、棉花，增加了轉基因作物的抗蟲譜，同時延緩了害蟲的抗性發(fā)展。Syngenta公司將Vip3a20基因通過農桿菌介導轉入棉花中獲得的轉基因棉花COT102進行注冊，該轉基因棉花對鱗翅目害蟲如棉鈴蟲、煙蚜夜蛾、粉紋夜蛾、秋黏蟲、甜菜夜蛾等均具有較高抗性[15]。而將Vip3a20轉入玉米中獲得的轉基因玉米MIR162已進行了全面的評估，發(fā)現(xiàn)其對環(huán)境和人類健康均無影響[15]。同時，該公司還注冊1種含有Vip3Aa和Cry1Ab基因的轉基因棉花VipCot。這種棉花通過轉Vip3A和Cry1Ab基因的棉花雜交獲得。該棉花表達高劑量的殺蟲毒素（轉基因棉花表達的毒素至少是此毒素殺死敏感昆蟲的25倍），對美洲棉鈴蟲和煙蚜夜蛾飼喂該棉花幼嫩葉片的試驗顯示，對2種害蟲的殺蟲率達到100%。人工接蟲試驗顯示，超過20 000頭的美洲棉鈴蟲或者煙蚜夜蛾被分別接種到轉基因植株上，經過7 d，植株上的害蟲只有幾十頭，經過14 d，害蟲全部被殺死。試驗結果表明，這種轉基因抗蟲棉對鱗翅目害蟲的防治效果良好[15]。另外，印度國際基因工程和生物技術中心利用合成的Vips基因構建的轉基因煙草和棉花也已在田間試驗[16]。

浙江大學沈志成實驗室（2006，中國專利，CN1818067A）構建了一個轉基因植物T-DNA載體，載體組件為全株表達的泛素啟動子和具有植物密碼偏好的Vip3基因。此載體用基因槍或者農桿菌的方法轉入植物愈傷組織中，使用愈傷組織進行生物測定。結果顯示，轉基因愈傷組織對稻縱卷葉螟、二化螟、玉米螟和秋黏蟲有100%的殺蟲活性。沈志成實驗室還將Cry-Vip融合基因構建成轉基因植物T-DNA載體轉入水稻中，成功獲得對二化螟和稻縱卷葉螟有抗性的轉基因水稻[17-18]。從2005年開始，中國科學院微生物研究所與山西省農科院棉花研究所等單位合作，開始進行Vip3A的棉花轉化與培育，現(xiàn)已通過農桿菌介導法獲得120個轉化后代，通過3 a的選育獲得了Vip3A蛋白表達量高的純合系，可望實現(xiàn)對棉花鱗翅目害蟲廣譜高抗的育種目標[19]。

4 展望

營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip極大地豐富了Bt的殺蟲毒素種類；由于營養(yǎng)期殺蟲蛋白與晶體毒素蛋白的殺蟲機理不同，而且營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip與Cry殺蟲晶體蛋白具有協(xié)同增效作用，所以，二者共同使用，不但能提高殺蟲毒力，更重要的是能夠有效地克服和延緩昆蟲對Bt毒素抗藥性的產生；這些特性將為人工構建特異高毒力工程菌和轉基因抗蟲植物提供新的思路和基因資源。隨著新的cry基因不斷涌現(xiàn)，必將為重要農業(yè)害蟲的防治提供更多的選擇，為Bt毒素殺蟲機理和抗性機制的基礎研究創(chuàng)造有利條件。

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