脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的細胞毒性作用

武慧慧 于愛蓮

(泰山醫學院，山東 泰安 271016)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名嘔吐毒素(vomitoxin)，屬于單端孢霉烯族毒素的一種，是由某些鐮刀菌屬產生的毒性代謝產物[1]。DON廣泛存在于各種糧谷類作物及其制品中[2]，性質極為穩定，在糧食的儲存和加工過程中不易被破壞，因此極易通過食物鏈引起人畜中毒[3]。現就 DON 的細胞毒性作用及其可能機制作一綜述。

1 DON的一般毒性作用

DON雖不及同族其他毒素如T-2毒素的毒性強烈，但因其污染率和污染水平均居單端孢霉烯族毒素之首，并常與其他真菌毒素協同作用于人體，可嚴重威脅人類健康。DON可產生廣泛的毒性效應，如急性毒性、慢性和亞慢性毒性、細胞毒性、免疫毒性等多種毒性作用[4]。此外，DON對血液系統、中樞神經系統、消化系統及鈣磷代謝亦可產生影響。

2 DON的細胞毒性作用

DON具有明顯的細胞毒性，它對于原核細胞、真核細胞、植物細胞和腫瘤細胞等均具有明顯的毒性作用。在植物細胞中, DON的主要作用是抑制有絲分裂，降低有絲分裂指數。在動物組織中DON主要作用于增長迅速、處于分裂狀態的細胞，如胃腸道細胞、淋巴細胞、胸腺細胞、脾細胞、骨髓造血細胞等，所引起的損害與輻射引起的細胞損害相似[5-6]。DON的毒性作用可能是由于其抑制了肽基轉移酶活性中心，并干擾了DNA連接酶的活性而影響蛋白質和DNA的合成。此外，DON還可抑制脂肪合成和磷脂攝取而損害細胞膜的功能[7]。

2.1DON對軟骨細胞的毒性作用

大骨節病多發于兒童和青少年，以關節軟骨、骺軟骨和骺軟骨板變性壞死為基本病變，真菌中毒說是大骨節病當今四大病因學說之一，流行病學調查結果顯示，病區DON檢出率與非病區有顯著差異。因此有學者采用體外培養關節軟骨細胞的方法，在培養液中加入不同劑量的DON，觀察DON對軟骨細胞的直接影響。超微結構觀察發現，DON對體外培養的兔關節軟骨細胞的膜系統和細胞器均可造成明顯損傷，培養早期的軟骨細胞損傷尤為嚴重；軟骨細胞趨于成熟后, DON對其結構和功能的損傷呈劑量依賴性；DON對于完全成熟的軟骨細胞則影響不大(濃度1.0～2.5 μg/ml)。這一結果符合大骨節病多發于生長發育期的少年兒童，并侵犯其未發育成熟的干髓端、髓板、骨髓、關節軟骨等現象。同時測定基質內葡萄糖醛酸和細胞內DNA的含量, 發現DON可劑量依賴性的減少細胞DNA含量，明顯抑制軟骨細胞分裂增殖[8]。彭雙清等[9]研究了DON對雞胚軟骨細胞的損傷作用，其超微結構的改變主要為軟骨細胞膜系統的損傷，與前述DON對兔關節軟骨細胞損傷的表現一致。給予相同劑量的同時,補充5 μg硒，可使DON對雞胚軟骨細胞的損傷程度明顯減輕，可見硒對DON造成的軟骨損傷有保護作用。DON 究竟是不是大骨節病的主要病因，還有待臨床流行病學調查和基礎醫學實驗等進一步探討研究。

2.2脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對腸上皮細胞的毒性作用

臨床實驗證明，低到中等劑量DON的急性暴露會引起受試動物的嘔吐、腹瀉和胃腸炎, 較高劑量則引起胃腸道黏膜上皮細胞的嚴重損害，造成出血、休克等[10]。經口攝入被DON污染的食物后，消化道上皮細胞便暴露在高DON濃度下，成為DON作用的主要靶點。豬是對DON毒性最為敏感的動物，用豬的腸上皮細胞系IPEC-J2為研究對象[11]，檢測DON作用下細胞的存活率和培養基中LDH的活性。結果可見濃度為2.5和10 μM 的DON染毒組細胞數量明顯減少，同時因細胞受損代謝減慢而導致ATP含量明顯減少，培養基中LDH的釋放量顯著增加。LDH是糖酵解過程中的關鍵酶，當細胞膜受損傷時便會逸出細胞外，使培養基中LDH活性增加。DON濃度為10 μM時，鏡下可見細胞形態的明顯改變，包括細胞變圓、溶解和脫落。說明DON確對消化道上皮細胞有直接毒性作用。

2.3脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對肝細胞的毒性作用

Mikami 等[12]將不同濃度的DON作用于體外培養的豬肝細胞，結果發現，10 μg/ml和100 μg/ml濃度組作用6h，以及0.1，1，10，100 μg/ml濃度組作用24 h，肝細胞出現凋亡，并隨DON濃度增高呈劑量依賴關系。肝細胞出現了染色質凝聚、核碎片等凋亡特有的形態學改變。DON對體外培養的人源肝細胞也有明顯的細胞毒性作用[13]，可劑量依賴性地降低細胞活力、蛋白質含量和白蛋白的分泌。DON通過激活凋亡關鍵酶Caspase -3誘導肝細胞凋亡，并引起LDH漏出等功能紊亂表現。此外，單細胞凝膠電泳顯示，DON還可引起離體培養的大鼠肝細胞DNA單鏈斷裂，造成DNA損傷[14]。DON在糧食中廣泛存在，提示人們警惕DON誘發肝臟疾病的潛在危險。

2.4脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對心肌細胞、血管內皮細胞的毒性作用

彭雙清等[15]報道，DON可減小體外培養大鼠心肌細胞的動作電位、最大除極速度、超射 (OS) 及閾電位，從而改變心肌細胞的去極化過程。除OS在DON為50 mg/ L時增高外，其余參數均存在明顯的劑量效應關系。其次，復極化過程也發生了改變，表現為DON可明顯延長復極化動作電位時程，減小最大舒張電位，抑制動作電位發放頻率。以上兩點表明DON可抑制大鼠心肌細胞的跨膜電位，用亞硒酸鈉對心肌細胞進行預處理，可發現DON對其動作電位的抑制作用明顯減弱，推測亞硒酸鈉可減輕DON對心肌細胞動作電位的影響，呈現明顯的保護作用。

血管內皮細胞形成血管光滑的內壁,在調節血壓、創傷修復、止血、血栓形成等一系列生理病理過程中起重要作用。將不同濃度的DON分別作用于豬髖動脈內皮細胞(PIEC) 和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)各24 h[16]，鏡下可見高濃度DON可使PIEC細胞貼壁數目減少，細胞界限不清，HUVEC細胞則變圓皺縮，形態均發生明顯變化。各濃度組DON均可對此兩種細胞產生增殖抑制作用，相同濃度的DON對PIEC的增殖抑制作用強于對HUVEC的增殖抑制作用,這可能與臨床上豬對DON的高敏感性有關。DON可誘導此兩種細胞發生凋亡，當DON濃度為0.5 mg/L 時, PIEC細胞的凋亡率達到最高；而當DON濃度為5 mg/L時, HUVEC細胞凋亡率達到最高。此后凋亡率隨濃度的升高而下降，這可能是由于凋亡細胞崩解脫離細胞片引起的。DON誘導PIEC細胞凋亡可能與Caspase-9途徑和促凋亡因子Bax有關，而在其誘導HUVEC細胞凋亡的過程中，Caspase-9和Bax 的變化未被檢測到。以上兩點可以推測，長期慢性暴露于DON污染的糧食及其制成品，可能會造成心肌電生理紊亂和血管內皮細胞損傷，從而導致心腦血管疾病。

2.5脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對腎細胞的毒性作用

Dinu 等[17]發現人胚腎細胞Hek-293的存活率隨DON劑量的增加而降低，IC50大約為7.6 μM。5 μm DON作用24 h, 可見細胞形態變圓，細胞器減少，Caspase-3表達量未見變化，Bcl-2表達量下調，細胞本身的抗氧化系統不能有效對抗DON的作用。應用彗星實驗觀察DON 對非洲綠猴腎細胞(Vero 細胞)的DNA損傷與修復的影響, 可見細胞受損數量和DNA 損傷程度隨染毒劑量和時間的增加而加重[18]。短時間染毒，損傷主要表現為DNA碎片的增加，較長時間染毒，則主要表現為DNA碎片變小。去除DON, 重新孵育若干時間，受損細胞能夠進行自我修復, 短時間染毒(4 h) 需要的修復啟動時間較短(<15 min) , 而長時間染毒(16 h) 需要的修復啟動時間則相應較長(>15 min)，可見，DON毒素可致Vero細胞DNA損傷，但這種損傷是直接性的，還是通過膜或代謝作用間接造成的, 其具體的機制仍需進一步探討 。

2.6脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠胚胎干細胞的毒性作用

本實驗室吳萍等[19]采用飼養層培養法體外培養小鼠胚胎干細胞(mES)，待其生長至對數期，加入不同濃度的DON作用24 h，觀察DON對ES細胞的毒性作用。檢測結果可見DON能抑制mES細胞的生長，影響細胞周期的分布，抑制細胞進入S期，使細胞停滯在G0/G1期，具有明顯的抗增殖作用。SSEA-1、Oct-4、Nanog是mES細胞的特異基因，DON作用于mES細胞可增加SSEA-1表達量，降低Oct-4、Nanog基因表達量，從而影響mES細胞的分化和發育。同時，DON在低濃度(10 ng/ml)時即可使NICD以及Jag-1、 Hes-1表達明顯減少，說明DON能夠抑制Notch信號通路的轉導，進而影響mES細胞的增殖及分化等。

2.7脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對免疫細胞的毒性作用

近年來，DON對免疫細胞的毒性研究逐漸增多。DON可誘導并促進免疫細胞凋亡、抑制其增殖，一些刺激因素如LPS可明顯增強其誘導凋亡抑制增殖的作用。從細胞凋亡與增殖的角度分析，DON主要表現為一種免疫抑制作用[20]。DON還可影響免疫細胞因子的分泌，根據DON濃度和作用時間的長短，DON對免疫細胞因子的作用既可表現為抑制又可表現為超誘導[21]。

李月紅等[22]研究了DON對小鼠胸腺細胞凋亡和增殖的影響。FCM結果顯示，各濃度組胸腺細胞的凋亡率均明顯高于對照組，其中4 mg/kg 和8 mg/kg DON處理組，S期和G2～M期的比例降低，且DNA瓊脂糖凝膠電泳出現了凋亡特有的DNA“ladder”，提示高濃度DON可明顯抑制小鼠胸腺細胞增殖。透射電鏡觀察DON處理過的胸腺細胞，可見核固縮、胞質空泡化等凋亡表現。4 mg/kg 和8 mg/kg DON處理組細胞甚至出現了胞核溶解消失、胞膜破裂等變性壞死的表現。王會艷等[23]以流式細胞儀DNA含量分析和DNA瓊脂糖凝膠電泳方法研究了DON對人淋巴細胞凋亡的影響。濃度分別為50，100，200，500，1000，2000 μg/L 的DON處理2～72小時，經流式細胞術檢測各實驗組淋巴細胞均出現了典型的亞二倍體凋亡細胞峰，凋亡百分率與毒素作用劑量和時間呈正相關。DON濃度為1000 μg/ L，處理24 h， DNA瓊脂糖凝膠電泳結果可見特征性的DNA“Ladder”條帶。據此，DON可誘導體外培養的人外周血淋巴細胞產生凋亡。

Islam等[24]研究了細菌脂多糖 ( LPS) 和 DON 聯合應用對小鼠胸腺 T細胞亞群、集合淋巴結和骨髓B細胞亞群凋亡誘導的影響。流式細胞定量分析表明, 兩者聯合處理12 h 可明顯促進胸腺內非成熟的 CD4-CD8-/ CD4+CD8+T淋巴細胞和成熟的CD4-CD8+T淋巴細胞凋亡的發生, 24 h后檢測到各群細胞數均減少，同時集合淋巴結成熟B淋巴細胞和骨髓成熟B淋巴細胞及前B淋巴細胞也發生明顯的凋亡。進一步研究發現, 糖皮質激素受體拮抗劑 RU486 可阻斷 LPS 和 DON 聯合誘導的上述各亞群淋巴細胞的凋亡, 有效保護細胞的減少。綜合分析提示, LPS 和 DON 聯合誘導淋巴細胞凋亡是通過糖皮質激素介導的。

2.8脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對胃癌細胞的毒性作用

DON不僅對正常細胞有毒性作用，對于腫瘤細胞亦有影響。有報道稱，DON可引起直接的DNA損傷，并通過細胞凋亡程序激活P53和Caspase-3從而誘導HT29(人類結腸癌細胞株)發生凋亡。邢欣等[25]將濃度分別為0，500，1 000 μg/L的DON分別作用于體外培養的胃癌細胞株SGC-7901和BGC-823，結果顯示DON可明顯抑制兩株細胞的增殖活性，且隨DON濃度增加，抑制率逐漸增高。DON抑制胃癌細胞增殖的機制包括：G2/M期阻滯、P21WAF/CIP1表達增高及細胞周期蛋白E表達下降。DON對分化程度不同的胃癌細胞的影響沒有明顯差別。又有研究[26]報道，DON可引起SGC-7901、BGC-823細胞發生凋亡，但凋亡率明顯低于正常細胞，提示DON的毒性存在細胞類型差異。DON誘導此兩種胃癌細胞凋亡的主要途徑是上調細胞內Bax蛋白表達量，同時下調Bcl-2蛋白表達量。

3 結 論

DON 在各種糧谷類作物中廣泛存在，其細胞毒性已經引起了各國研究者的重視。綜合目前的研究結果來看, DON 的細胞毒性作用主要表現為以下幾個方面: (1)DON的細胞毒性非常廣泛，對正常細胞和腫瘤細胞均可產生毒性作用。(2) DON的毒性效應存在物種來源和細胞類型的差異，作用機制亦有差別。(3) DON的細胞毒性作用主要是抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，且其毒性作用有時間和劑量的依賴性。目前, DON 的細胞毒性作用多集中在損傷現象的研究, 今后的研究方向應當包括以下幾個方面: (1)進一步研究 DON 的細胞毒性作用機制及其通路，同時進行更為廣泛的流行病學研究，證明DON污染與人類疾病之間的關系。(2)加強對多種真菌毒素聯合作用的關注。(3) 加強糧谷作物防霉技術、DON降解和去除技術的研究及專業技術人才的培養，以期為防治DON提供技術支持。

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