口腔癌動物模型建立的研究進展*

倪春曉 李曉光

(1.泰山醫學院，山東 泰安 271016； 2.泰山醫學院附屬泰山醫院，山東 泰安 271000)

口腔癌是目前世界上最常見的十大惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的 5%，其中，90%為上皮源性的鱗狀細胞癌。近年來口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的發病率呈上升趨勢，發病年齡也趨于年輕化[1-2]。因而建立與人類口腔癌相似的動物模型，有利于探討口腔癌的病因、發展、浸潤和轉移?？谇话﹦游锬Ｐ偷慕⒎椒壳俺Ｓ玫挠谢瘜W誘導劑法、腫瘤細胞株接種法或腫瘤組織塊移植法、基因突變法等。本文就口腔癌動物模型建立方法的研究進展作一綜述。

1 化學誘導劑法

化學試劑誘導發生口腔惡性腫瘤是最常見的一種方法，也比較成熟，半個世紀以來一直被國內外許多學者采用。此類制作方法的優點是：可較好的模仿人類口腔癌的發生過程，能在嚴格控制各種條件下短時間內復制出大量口腔惡性腫瘤動物模型。缺點是：制作周期長，腫瘤發展緩慢；且所建立的動物模型和自然產生的疾病模型在某些方面還存在一定程度的差異。因此，這類制作方法多用于腫瘤的病因學及預防研究,不利于做腫瘤治療及進展研究。

1.1實驗動物的選擇

迄今為止，國內外學者使用的實驗動物主要有金黃地鼠、小鼠、大鼠、倉鼠、裸鼠[3]等，其中以金黃地鼠、大鼠、小鼠為常用。

金黃地鼠因為存在特殊的解剖結構頰囊(頰囊被覆角化復層鱗狀上皮，對致癌劑敏感，常作為誘癌的部位[4])，被廣泛作為誘癌動物。實驗性金黃地鼠頰囊癌被認為是一個簡單、方便、重復性好、較穩定而又容易建立的口腔粘膜化學致癌動物模型，在癌癥的病因、病理、治療實驗中得到廣泛應用。用于實驗的金黃地鼠最適宜的鼠齡是 5 周，體重一般是60～80 g。大鼠因食性廣泛，容易飼養，亦常作為誘癌動物，常用的有Wistar大鼠和 SD 大鼠。用于實驗的 Wistar 大鼠一般為 6～8 周鼠齡，體重為150～180 g；SD 大鼠鼠齡為130～150 d，體重為 180～230 g[3]。小鼠性溫順、易捕捉，也可用作誘癌動物，用于實驗的小鼠鼠齡約為40 d ，體重為 18～25 g[7-8]?？捎脕碚T導牙齦癌、上腭癌、舌癌等[5]。

1.2致癌劑的選擇

應用于口腔惡性腫瘤動物模型誘導的致癌劑分為以下幾種：二甲苯蒽(10-dimethyl-1,2-benzanthracene,DMBA)，5-溴脫氧尿苷(5-bromodexyuridine,BrdUrd)，N-氧化-4- 硝基喹啉(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)，3-甲基膽蒽(methylcholanthrene,MCA)，拉帕醇(lapachol,LAP)，二氯甲烷(methylene chloride)，碘化鉀(potassiumiodide,KE)，磷酸鉻(chromic colloidal phosphate,CCP)，其中最常用的是DMBA,其次還有4NQO及MC[6]等。

DMBA是多環芳香烴類致癌物，是直接致癌劑， 對上皮細胞的 DNA 有較強毒性，當一定量的 DMBA 經歷一段時間積累作用于黏膜上皮細胞后，DNA 發生突變，細胞發生異常增生，被廣泛應用于動物腫瘤模型的建立。DMBA 為黃色粉末，可用液體石蠟或丙酮配制成 0.5%溶液，使用方法是口腔黏膜局部涂抹法或直接注射法。

4NQO 是水溶性喹啉衍生物，是一種很強的水溶性前體致癌劑，屬芳香胺雜環化合物。在體內被 4NQO 還原酶代謝為近致癌物 4-羥氨基喹啉-1-氧化物，再進一步代謝為終致癌物 4-乙酰氨基喹啉-1-氧化物(4-AAQO)，4-AAQO以共價鍵的方式與靶器官細胞 DNA 結合，并破壞染色體的結構,使鼠第 7 號染色體上 H-ras1 基因第 12 位密碼子發生 G→A 轉換，進一步影響抑癌基因和癌基因表達,最終導致癌發生[7]。4NQO呈淡黃色粉末狀，可配置成 0.5%的 4NQO 丙二醇溶液或二甲亞砜液，也可用蒸餾水配成 0.1%溶液，使用方法是用自來水稀釋成0.002%濃度放到避光瓶中由動物自由飲用。

MCA為淺黃色細長棱柱體結晶，可溶于二甲基亞砜(DMSO)，溶于苯、甲苯和二甲苯,微溶于戊醇,不溶于水。常用來誘導培養細胞的轉化,在實驗動物身上誘導纖維肉瘤和皮膚癌。常用使用方法是直接注射法。

1.3實驗方法

1.3.1DMBA 或4NQO溶液涂抹法 Siddavaram Nagini 等[8]用0.5%的DMBA 石蠟油溶液涂抹金黃地鼠頰囊，每周 3 次，連續 14 周，所有鼠均誘導出分化良好的鱗癌.邱存平等[9]采用DMBA涂抹金黃地鼠舌粘膜的同時分別使用刺破粘膜和切割誘發腫瘤，每周2次,共 25周；結果成瘤率為95% (38/40),實驗動物均經歷了上皮異常增生、原位癌、浸潤癌和轉移癌幾個階段，3只金黃地鼠出現頸淋巴結轉移，組織學呈高分化鱗狀細胞癌表現。鄭金華等[10]采用1%DMBA丙酮液涂抹聯合應用舌創傷致 SD 大鼠和金黃地鼠左側舌癌，共 24 周；結果SD 大鼠和金黃地鼠 3 d 后舌背黏膜左側緣相繼出現潰瘍、白斑、腫大；SD大鼠 8 周可見上皮層增生和基底膜細胞的異型性改變，16 周癌變的基底細胞突破基底膜向深層浸潤，鏡下見癌細胞分化程度差，無角化珠形成，致癌率 76.6%；金黃地鼠 8 周出現黏膜白斑或乳頭狀突起，繼之出現黏膜糜爛，10 周逐漸形成外生性腫塊，鏡下見癌細胞分化程度高,有角化珠形成，致癌率為 93.3%。Cavalcante DR等[11]用 DMBA 溶液涂抹大鼠舌背，每周3次，連續 20周，成功建立了大鼠舌癌模型。Burns JA等[12]應用DMBA溶液涂抹21只倉鼠的頰囊，結果19只倉鼠成功建立頰囊部的鱗狀細胞癌。Hsu WH[13]及Rajkamal G等[14]應用0.5%DMBA溶液涂抹金黃地鼠頰囊，每周3次，共14周，成功建立口腔鱗狀細胞癌。段開文等[15]采用 0.5% 4-NQO丙二醇液涂抹27只Wistar大鼠腭中部每周 3次，成功獲得大鼠腭粘膜癌變的各期組織。

1.3.24NQO 溶液飲用法 李文薈等[16]采用4NQO溶液飲用法，對20只SD大白鼠舌粘膜進行誘癌實驗，至32周時，20只大鼠有14只出現高分化鱗狀細胞癌，3只為原位癌，余 3只為輕、中度異常增生。卜冬平等[17]采用0.001%和0.002% 4NQO飲水喂養Balb/c小鼠16～28周，結果顯示0.001% 4NQO是誘發小鼠舌癌前病變的理想濃度，0.002%是誘發小鼠舌癌的理想濃度。 陳慧等[18]采用100 μg/ml、50 μg/ml、10 μg/ml的4NQO通過飲水法作用于C57BL/6小鼠，結果可以觀察到舌和食管的病變經歷了單純性上皮增生—異常增生—原位癌—浸潤性癌這樣一個經典的鱗狀上皮細胞癌的病變過程。El-Rouby DH等[19]使用4NQO飲水法成功誘導出舌鱗狀細胞癌。Zhou G等[20]采用100 μg/ml的4-NQO飲用水喂養CBA小鼠8周，成功建立小鼠口腔癌模型。

1.3.3DMBA 或MCA直接注射法 張寶平等[21]選取60只金黃地鼠采用預設濃度為0.4%,0.3%,0.2%,0.1%的DMBA丙酮注射法建立金黃地鼠頰囊癌模型,結果顯示12W時成癌率分別為25%，87%，42%，58%。李懷奇等[22]采用2%DMBA溶液注射入20只大鼠的頜下腺(每只0.05 ml)，在開始實驗1周后給予含0.05%苯巴比妥的飼料喂養3個月，結果誘瘤率為22%。馬長路等[23]將MCA直接注射于46只SD大鼠頜下腺腺體內,共誘發產生腫瘤34例,其中鱗狀細胞癌4例,平滑肌肉瘤30例。

1.3.4DMBA局部植入法 Sumitomo等[24]用DMBA明膠海綿塊植入法成功誘發腫瘤，病理證實為鱗癌。曹選平等[25]用含有2%DMBA的明膠海綿塊(1 mm×1 mm×1 mm,約含DMBA 1.0 mg)植入大鼠頜下腺體內的方法,對50只SD大白鼠頜下腺進行誘癌實驗,共誘發腫瘤21例,均為鱗狀細胞癌。

2 腫瘤細胞株接種法或腫瘤組織塊移植法

這是80年代初興起的一種方法，即將活體腫瘤細胞株或腫瘤組織塊植入動物體內而建立腫瘤動物模型。此類制作方法的優點是保留了人類口腔癌的部分病理學、生物學特性，可以觀察到腫瘤的浸潤和轉移過程；缺點是需要一定的外科手術技術和無菌條件，每次接種耗費時間較長，實驗動物受手術創傷較大，術后感染、創口的粘連、腫瘤壞死率高等。

2.1實驗動物的選擇 目前該種實驗方法常用的動物是小鼠、裸鼠和新西蘭大白兔等。用在腫瘤原位移植中的小鼠體重一般為 18～24 g；裸鼠，鼠齡 3～5 周，體重一般為 18～20 g。近年來，許多學者選擇應用新西蘭大白兔作為實驗動物建立口腔癌動物模型，且所建立的動物模型與人類口腔癌相似，而且由于兔體質量相對較大，有利于CT等影像設備成像顯示，同鼠類小動物模型相比有無法比擬的優勢。用在實驗中的新西蘭大白兔一般為 2～3 個月齡，體重 1.5～2.0 kg 。

2.2腫瘤細胞系或株的選擇 常用的細胞系或株有Tca8113細胞系、AT-84細胞系、SCC Ⅶ細胞系等，近年來許多學者嘗試應用VX2細胞株。VX2細胞株是一種得到廣泛承認的可移植的腫瘤細胞株,具有誘導時間短、侵襲性強、血供豐富、種植成功率高的特點，且生物學性質穩定，可種植于兔的多個部位建立原位腫瘤動物模型，早期就可發生肝、肺、縱隔等處轉移[26]。用VX2腫瘤細胞株建立口腔局部腫瘤模型發展較臨床其他疾病研究晚許多，也是近幾年來才有學者試著用VX2瘤株植入到兔舌部或頰部等部位來建立動物模型，且初步研究證明所建立的這種兔VX2鱗狀細胞癌模型操作簡單，成瘤率高，且其在生化學、形態學和生物學行為上與人類鱗狀細胞癌具有較高的相似性，而且不會產生特異性的抗體，能較好的體現原位癌的特點。 Jefferis等[27]首先報道了兔舌VX2鱗癌模型的建立。

2.3實驗方法

2.3.1人類口腔癌種植于裸鼠 Cui等[28]采用人體鱗癌細胞懸浮液(細胞濃度1×105個/ml)注入鼠咀嚼肌，成功的建立了下頜骨鱗癌浸潤動物模型。Qiu等[29]將人舌癌淋巴結轉移標本同位移植到裸鼠的舌部，成功建立了舌鱗狀細胞癌裸鼠模型。 張燕等[30]選取新鮮的口腔鱗癌手術標本,制備成1 mm3組織塊，植入BALB/c nu-nu裸鼠皮下，成瘤率為56%(15/27)。唐瞻貴等[31]將人口腔疣狀癌伴灶性鱗癌頸淋巴轉移組織,通過組織塊皮下接種法建立轉移灶模型，成瘤率87.5% (7/8)，且移植瘤具有人疣狀口腔癌轉移灶組織類似的形態學特征。

2.3.2細胞系注射法 常用細胞系有Tca8113、AT-84、SCC Ⅶ細胞系等。余楊等[32]通過在裸鼠舌體及頰黏膜內注射接種Tca8113細胞，建立移植瘤動物模型；結果13只舌體接種移植瘤裸鼠中，有 3只出現下頜下淋巴結轉移，5只出現淋巴結微灶轉移，轉移率達到61.54%。15 只頰黏膜接種移植瘤裸鼠中，3 只出現下頜下淋巴結轉移，3 只出現淋巴結微灶轉移，轉移率為 40.00%。 姚金光等[33]將舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞注射于裸鼠爪墊皮下的方法建立舌鱗狀細胞癌淋巴道轉移裸鼠模型，成瘤率為67.5%。Takeshi Nomura 等[34]將SCC Ⅶ細胞系注射入C3H/HeN 小鼠的咬肌區域，建立了侵犯頜骨的口腔癌模型。

2.3.3動物瘤株或組織塊口腔原位種植 最常用的為VX2細胞株。此類制作方法細分為VX2細胞懸液注射，VX2組織塊接種法，VX2瘤組織塊懸液注射法[26]。Lin LM等[35]將VX2新鮮實體瘤塊種植到8只兔子的左臉頰,造成口腔潰瘍，6周后，8只動物均發現低分化SCCs腫瘤生長，無內部器官轉移，在8只兔子中的4只發現11個頸部淋巴結轉移，平均每只兔子2.75頸部淋巴結，同時還注意到1只動物有下顎骨和牙齒牙髓癌細胞入侵；結果表明，兔VX2誘導兔口腔癌可能是人類口腔黏膜鱗狀細胞癌中潛在的癌癥模型。Liao GQ等[36]采用VX2組織塊移植法建立兔VX2舌鱗癌移植瘤模型，成瘤率為83.3%。田軍等[37]采用3種不同移植瘤方法：瘤組織塊植入法、改良瘤細胞懸液注入法、瘤細胞懸液注入法，于兔舌側緣中1/3黏膜下建立穩定的兔VX2舌鱗癌移植瘤模型，成瘤率分別為83.3%，91.7%，33.3%,局部淋巴結轉移率分別為71.4%，100.0%，37.5%,肺轉移率分別為35.7%，81.3%，0。沈毅等[38]將新西蘭白兔20只,隨機分為4組,每組5只,分別植入VX2鱗癌瘤塊，結果總成瘤率為75%,其中舌緣80%,舌中線區70%,頸淋巴結轉移率均70%,舌癌和頸部轉移淋巴結均為低分化鱗癌。

3 轉基因法

這是 90 年代以來新發展起來的一種實驗方法，常用的方法主要有顯微注射法、逆轉錄病毒載體法、胚胎干細胞法、電脈沖法、精子載體導入法等。此類制作方法的優點是：可以從分子水平研究口腔癌的形成過程中各種分子的改變；利用此技術可以精確地失活某些基因或增強某些基因的表達。缺點是：通常有外源基因的引入；轉錄效率低；在宿主基因組中的行為難以控制；導致基因的完全突變或缺失；有時不能表達或表達混亂以及不能遺傳給后代等；且轉基因動物的成活率低，易形成多個原發腫瘤且不能形成多個突變和轉移等。因此，這種制作方法也不常應用。

4 展望

近年來隨著口腔頜面部腫瘤動物模型的制作成功，尤其是兔VX2口腔頜面部腫瘤動物模型的建立獲得了較滿意的效果，為研究相關腫瘤的生物學行為提供了臨床依據。在大型動物模型的研究上具有很高的應用價值，擬用于臨床抗癌藥物的篩選，最佳化療方案的選擇，一些緩釋藥物在口腔腫瘤治療中的應用及放化療結合治療在頜面部轉移癌的療效機制。隨著認識的不斷深入，兔VX2口腔頜面部腫瘤模型將會被應用于更多的領域。

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