辣椒游離小孢子培養研究進展

成 妍，馬蓉麗，焦彥生，吳海濤，巫東堂

（山西省農業科學院蔬菜研究所，山西太原 030032）

辣椒（Capsicum annuumL.）原產于中南美洲，明末傳入我國并被廣泛種植，是人們廣為熟知的一種蔬菜和調味品，它包括有辣味的辣椒（chili pepper）和無辣味的甜椒（sweet pepper）[1]。由于辣椒是常異花授粉植物，雜種優勢十分明顯，因此，其單倍體遺傳育種研究具有非常重要的意義。

自1973年王玉英等[2]以躍縣小辣椒為試材進行花藥培養獲得植株以來，國內外眾多學者在辣椒花藥培養研究方面進行了大量研究[3-4]，使花藥培養成為目前獲取辣椒單倍體較成熟的技術，已被應用于辣椒的遺傳育種工作中[5-7]。游離小孢子培養與花藥培養相比，不僅單倍體再生率高，而且避免了愈傷組織和體細胞胚的產生。同時，小孢子的單倍性和單細胞特性為遺傳轉化提供了好機會[8-10]。目前，有關辣椒游離小孢子培養的成功報道較少，還沒有達到建立起完善、高頻的小孢子培養再生體系的程度，不能應用于遺傳育種或基礎性研究，因此，非常有必要對辣椒游離小孢子培養技術及其影響因素進行深入細致的摸索研究。

1 供試材料對胚胎發生的影響

1.1 基因型

胚狀體的誘導與供體基因型密切相關。不同基因型植株在同樣的試驗條件下，游離小孢子培養的誘導頻率差異很大[11]。基因型對小孢子胚胎發生能力的決定作用主要體現在2個方面：一是基因型的反應范圍，二是胚胎發生頻率的差異[12]。Supena等[13]采用相同的培養條件對印度尼西亞辣椒的10個基因型進行培養，結果表明，不同基因型間胚產量差異顯著，胚產量最高的可達31.5胚/蕾；同時發現，光皮類型的培養效果優于皺皮類型。李春玲等[14]對燈籠椒、牛角椒、羊角椒、線形椒和朝天椒分別進行游離小孢子培養，發現除朝天椒05-1007僅獲得小孢子愈傷組織外，其余品種均得到了小孢子愈傷組織和胚狀體。王燁等[15]研究了5個辣椒品種小孢子離體培養前期的存活率，認為基因型不同導致對不同預處理的反應不同。

1.2 供體植株的生理狀況

不同栽培環境、不同花期、不同部位的花蕾，其花粉的生理狀況不同，會導致小孢子胚誘導率的差異[16]。Kim等[17]在人工氣候室采用25℃/20℃的晝夜溫度和16 h/8 h的光周期，小孢子培養的出胚率較高。在無人工氣候室的情況下，可利用溫室和田間具備供體植株適宜生長溫度的季節，即每年春秋季開展工作。在夏季溫度較高時，采用降溫措施使溫室中溫度低于30℃，在秋季光照不足時進行人工補光，以維持植株正常生長。不同花期和不同部位的花蕾由于營養狀況不同，其中適于培養的小孢子所占的比率不同，導致產胚率的差異。進行人工整枝、連續摘除將要開放的花蕾及幼果，可使幼小的適宜取材花蕾發育良好[18]。

1.3 小孢子發育時期

小孢子發育時期通常分為單核期、雙核期和三核期，而并非任何時期的小孢子都適于培養。單核期又分為單核早期、單核中期和單核靠邊期[19]。通常最適宜游離小孢子培養的時期為單核靠邊期。張祖姣等[20]研究了興蔬301不同大小花蕾的細胞學和形態學關系，發現辣椒小孢子發育不同時期花蕾和花藥的大小差異顯著或極顯著，依據花器官形態特征可判斷小孢子的發育時期。張菊平等[21]也認為，辣椒小孢子發育時期與花蕾的外部形態特征、花藥顏色密切相關。張芳等[22]對6個不同果形和果味辣椒材料的3個相同取蕾時期的花藥進行染色觀察，比較發現，不同基因型辣椒的相同花器官外部形態所對應的小孢子發育時期存在一定的差異，但各品種與單核晚期相應的花器官外部形態特征存在共性，即花蕾的花瓣長于萼片0.12 mm，花藥尖部略微紫色（到背面1/3處紫色）時，各個材料的小孢子大部分均處于單核期。

2 培養技術對胚胎發生的影響

2.1 分離小孢子的方法

目前，主要是通過自然釋放和機械擠壓這2種方法得到游離小孢子。Supena等[13]采用液固雙層培養基進行小孢子看護培養，2～3周后花藥正常開裂，將小孢子釋放到培養基中。自然釋放法的優點是不會對小孢子造成損傷，但培養效果不佳，研究者多采用機械擠壓方法[3]。劉凡等[9]、李春玲等[14]首先對花藥進行15 d的預培養，然后采用直接擠壓法得到游離小孢子。Kim等[17]用微型攪拌器高速研磨花藥10 s得到游離小孢子。另外，利用Percoll密度梯度離心來分離膨大的小孢子，可以達到純化的效果。

2.2 小孢子接種密度

接種密度大小對小孢子培養具有十分重要的作用，它影響胚誘導和小孢子發育進程。Kim等[17]在4×104～16×104個/mL之間設置了6個不同的小孢子接種密度，發現每皿產胚量與小孢子接種密度成正比。但密度太大、太小都會影響子葉形胚的產量。采取4×104個/mL的接種密度在培養3周時未見胚狀體產生，隨著培養時間的延長，只能產生極少量的子葉形胚。采取16×104個/mL的接種密度在培養3周時就能產生大量球形胚，但這些球形胚從此停止發育。最優的接種密度是10×104個/mL。

2.3 基本培養基

辣椒游離小孢子培養的基本培養基主要有CP，NLN，MS等。Mityko等[23]比較了 3 種基本培養基（NLN，R92，CP）的誘導效果，發現小孢子在NLN培養基中培養時可獲得最多數量的多細胞團。劉凡等[9]和李春玲等[14]分別采用CP基本培養基進行辣椒游離小孢子培養，取得了理想的結果。Supena等[13]比較了在MS培養基上進行小孢子看護培養和在AT3培養基上進行游離小孢子培養的效果，認為前者更適合于辣椒小孢子培養。Kim等[17]在小孢子預處理時對比了無碳源培養基和B5培養基，結果顯示，前者對于胚的誘導更有效。

2.4 碳源

一定濃度的糖類物質的添加既可作為碳源，又具有維持培養基滲透壓的作用，常用的糖類物質有蔗糖、麥芽糖。Supena等[13]進行小孢子看護培養時使用濃度為2%的麥芽糖。Kim等[17]分別比較了6%，9%和12%的3種蔗糖與麥芽糖對小孢子胚誘導能力的影響，結果表明，采用添加蔗糖的培養基所獲得的胚狀體不僅在數量上而且在質量上均優于麥芽糖，且9%的蔗糖誘導效果最好。王燁等[15]研究表明，無碳源的花藥預培養對提高小孢子存活率作用明顯。

2.5 活性炭

在培養基中添加活性炭可吸附培養過程中小孢子釋放的毒性代謝物質，如ABA和酚類化合物等，從而促進小孢子胚的發生、發育。陳曉等[11]在辣椒花培試驗中發現，添加活性炭能提高胚狀體的誘導率，0.25%～0.5%范圍內的活性炭得到的誘胚率差異不明顯。Supena等[13]在對印度尼西亞辣椒的小孢子看護培養中，研究了不同活性炭濃度對小孢子培養的影響，表明活性炭對小孢子胚的形成是必需的，且活性炭的最適濃度為1%，低濃度的活性炭可增加小孢子胚總產量和子葉形胚產量，但高濃度的活性炭會影響小孢子胚的成苗。

2.6 溫度脅迫

溫度脅迫是影響小孢子胚狀體發生的最主要因素。一般來說，從植株上采下花蕾后，直接進行小孢子培養，很難誘導胚狀體發生。溫度脅迫可改變小孢子發育途徑，從而阻止小孢子向成熟花粉粒方向發展，沿著胚胎的發展途徑，最后形成胚[9]。劉廣霞等[24]認為，4℃低溫預處理花蕾能大大提高胚狀體誘導率。王燁等[15]研究表明，4℃的花藥預培養對提高小孢子存活率作用明顯，并且對5個供試品種都有作用。Supena等[13]認為，辣椒小孢子看護培養首先在4℃下處理花蕾1 d，然后9℃處理接種于固液雙層培養基中的花藥1周，可獲得最佳效果。李春玲等[14]采用35℃的高溫脅迫成功完成了胚胎發生和成苗。劉凡等[9]認為，游離小孢子細胞團培養中以35，32℃預處理下的出胚率較好，7℃處理下獲得的胚狀體很少，而在溫度處理的不同天數間差異不明顯。Kim等[17]在（31±1）℃下熱激 3 d，取得了較好的培養效果。

2.7 激素

植物激素是調節細胞分裂和伸長的一類活性物質。培養基中激素種類和濃度，常對調控細胞的分裂、生長和分化起著極為重要的作用[14]。Supena等[13]研究發現，在小孢子看護培養的上層液體培養基中添加2.5 μmol/L玉米素和5 μmol/L IAA能顯著提高小孢子胚總產量和子葉形胚產量。劉廣霞等[24]認為，MS培養基中添加0.1 mg/L的2，4-D或KT可以提高花培效果，較高質量濃度的NAA（1.0 mg/L）的胚狀體誘導率達到最高。然而，劉凡等[9]研究初步表明，液體培養基中高水平的激素對促進胚狀體細胞的分裂和分化沒有積極作用。同樣，Kim等[17]和李春玲等[14]都采用不含激素的培養基獲得了較高的胚誘導率。

3 雄核發育和胚胎發生

接種后能夠膨大的小孢子會繼續發育，皺縮的小孢子則死亡。李春玲等[14]研究表明，不同類型辣椒游離小孢子的雄核發育與胚胎發生程序相同。小孢子最初的細胞分裂有均等和不均等這2種方式。脫分化的小孢子可經歷胚胎發生和器官發生2種發育途徑，二者之間也可相互轉換。小孢子在分裂早期如果突破花粉壁會形成薄壁細胞團，繼續發育為愈傷組織，進而轉向器官發生途徑。小孢子愈傷組織易形成不定根，也可形成次生胚狀體，但未觀察到不定芽的發生。辣椒游離小孢子胚胎發生過程與合子胚發育過程相似，3周可見球形胚與心形胚，4周出現子葉形胚[17]。胚狀體發育具有高度不同步性，其中，只有20%的是正常完整的子葉形胚（由胚根、胚軸和子葉3部分組成）[13]。

4 小孢子胚的植株再生

成熟的胚狀體轉移至再生培養基上，給予適宜的溫度和光照條件，1～2 d可轉綠，5 d內生根，1～2周便可萌發為完整植株[17]。胚狀體胚芽、子葉端發育及萌發能力明顯低于胚根端[14]。在所有的胚狀體中僅有5%能成苗，而具有2片子葉的胚狀體成苗率可達100%。正常小植株極易移栽成活[13]。

5 小孢子植株的倍性鑒定及其加倍處理

小孢子植株倍性鑒定的方法主要有染色體計數法、流式細胞測定法、形態學鑒定法、細胞學特征鑒定法等[25]。劉凡等[9]取繼代培養中生長良好的小孢子苗的葉片，采用流式細胞儀進行染色體倍性分析，結果表明，獲得的再生株中具有單倍體、雙單倍體以及單倍-雙倍嵌合體植株。由于胚狀體發育早期鏡檢顯示，分裂細胞團來自小孢子，因此，后二者應該是小孢子細胞團分裂分化過程中，染色體自然加倍形成的雙單倍體材料，以及可能在同一細胞團中，部分細胞染色體發生了加倍，而部分細胞沒有染色體加倍產生的混倍體材料。單倍體人工加倍的方法以化學誘變法最常用，常用的誘變劑有秋水仙堿、氟樂靈、對二氯苯、8-羥基喹啉等，其中，以秋水仙堿加倍效果最好。用秋水仙堿溶液處理根、芽等分生組織，或直接加在培養基中，都可以起到一定的加倍作用。

6 存在問題與展望

目前，辣椒游離小孢子培養技術在實踐中還存在很多問題，如：材料不易消毒滅菌，污染嚴重；花藥壁厚，脆性大，不易獲得干凈高活力的小孢子；小孢子游離后活力容易喪失；在所有誘導產生的小孢子胚中，發育完整的子葉形胚數量少；非子葉形胚成苗難；單倍體小孢子植株人工加倍率低等[19]。這些問題困擾著無數研究者，亟待解決。辣椒已有通過花藥培養而成的品種在生產中推廣應用，但小孢子培養育成的辣椒品種還沒有報道。現今大部分研究成果仍只停留在實驗室階段，不能投入到實際生產中去。

在今后的研究中應加強理論和實驗技術方面的工作。不僅要研究辣椒小孢子胚胎發生和小孢子胚植株再生的影響因素，以及小孢子再生植株倍性鑒定和染色體加倍技術，改進培養方法、培養基配方及培養條件，建立能穩定、高效地獲得純合二倍體的辣椒游離小孢子培養體系，而且要深入探討小孢子發育的調控機理，為該技術發展提供理論依據。相信在不久的將來，通過國內外研究者進一步深入系統研究，辣椒游離小孢子培養必然會有廣闊的發展前景。

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