非小細胞肺癌患者癌組織、外周血中hnRNP A2/B1 mRNA的表達變化

龍穎穎，古 艷，李 羲，顏春松

(1南昌大學第二附屬醫院，南昌330006;2南昌大學第三附屬醫院;3海南醫學院附屬醫院)

肺組織病理學檢查是診斷肺癌的金標準，但該檢查為有創操作，可能導致患者病情加重，且部分肺癌晚期患者難以取得癌組織標本。因此，尋找一種無創且有助于肺癌早期診斷的方法具有重要意義。隨著分子生物學的迅猛發展，越來越多的學者將研究的重點轉向腫瘤標志物的監測，現在已發現與肺癌有關的腫瘤標志物有10余種。異質性胞核核糖核蛋白A2/B1(hnRNP A2/B1)是一種癌生長蛋白，與非小細胞肺癌(NSCLC)的發生發展密切相關［1］。本研究觀察了hnRNP A2/B1基因在NSCLC患者外周血單個核細胞及癌組織中的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 NSCLC患者37例(肺癌組)，男29例、女8 例，年齡(63.49±13.76)歲;均未行放化療及其他抗腫瘤治療，于2009年12月～2011年12月行手術治療留取癌組織，經病理檢查確診。其中鱗癌26例，腺癌8例，大細胞癌2例，肉瘤1例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期21例。肺部良性病變20例(良性組)，男16例、女4例，年齡(57.32±15.69)歲;其中間質性肺炎16例，肺囊腫4例。兩組性別、年齡具有可比性(P均＞0.05)。

1.2 hnRNP A2/B1基因檢測方法

1.2.1 RNA的提取 取100 mg新鮮肺病變組織標本勻漿，加1 mL Trizol混勻，室溫放置5 min;加入氯仿0.2 mL，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。4℃10 000 r/min離心15 min，樣品分成黃色的有機相、中間層和上層無色的水相。把水相移到新EP管中，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃放置20 min。4℃ 10 000 r/min離心10 min，去上清可見白色絮狀物即RNA。加入75﹪乙醇1 mL(用無核酶水配置)洗2次。室溫放置晾干，加入無核酶水20 μL充分溶解RNA，電泳檢測提取RNA的質量及效果。取1 mL新鮮血液加入3 mL紅細胞裂解液，混勻后室溫放置10 min，4℃ 10 000 r/min離心5 min，棄上清，收集白細胞沉淀。在白細胞沉淀中加入1 mL Trizol混勻，15～30℃放置5 min，使核酸蛋白復合物完全分離;4℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清。后續步驟同肺病變組織RNA的提取。

1.2.2 RT-PCR 取 RNA 10 μL，用 0.05 μg/μL Oligo(dT)15 Primer 2 μL 及無核酶水 2 μL 混勻。快速加入 5 × M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、Rnasin 0.5 μL、dNTP 1 μL 及無核酶水 3.5 μL 后混勻，42℃水浴60 min獲得cDNA產物。以cDNA為模板進行hnRNP A2/B1及 β-actin的 PCR反應。具體操作:室溫下加入 cDNA 模板 5.0 μL，hnRNP A2/B1 Primer(10 μM)1.0 μL，β-actin Primer(10 μM)1.0 μL，2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，共計25 μL，置 PCR 儀進行擴增。反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35循環，最后72℃延伸7 min。取 PCR 產物10.0 μL及 DNA Marker 5.0 μL于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳。將電泳產物切膠回收并純化，用10 μL三蒸水溶解，取1 μL用核酸蛋白測定儀檢測hnRNP A2/B1基因。

1.3 統計學方法 采用SSPS13.0統計軟件。所得數據以±s表示，組間比較用t檢驗;相關性分析采用直線相關分析法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

肺癌組癌組織與外周血單個核細胞中hnRNP A2/B1 mRNA 分別為(0.82±0.49)、(0.69±0.48)μg/μL，良性組分別為(0.16± 0.25)、(0.13±0.20)μg/μL;兩組比較，P 均 ＜0.05。NSCLC 患者TNM分期Ⅰ～Ⅱ期者癌組織與外周血單個核細胞中 hnRNP A2/B1 mRNA 分別為(0.68±0.45)、(0.57±0.47)μg/μL，均低于Ⅲ ～ Ⅳ期的(0.93±0.49)、(0.78±0.4)μg/μL(P 均 ＜0.05)。肺癌患者癌組織與外周血單個核細胞中hnRNP A2/B1 mRNA 的表達呈正相關(r=0.941，P ＜0.05)。

3 討論

hnRNP是一組核內RNA結合蛋白，是由30多個蛋白質小分子構成的復合體，其功能主要與RNA轉錄、外顯子剪接、剪接位點選擇以及Pre-mRNA的成熟和降解有關［2］。hnRNP A2/B1是hnRNP的主要組成部分，它可在核內連接前RNA，并在RNA處理和連接位點的選擇中起重要作用;此外，hnRNP A2/B1可在核與胞質間穿梭，具有將mRNA輸出到胞質的功能;hnRNP還參與RNA的代謝、轉錄和DNA 復制［3～5］。hnRNP A2/B1 在正常肺發育的關鍵階段過度表達，表達水平與肺癌及癌前病變類似，其在成熟肺組織中的表達被抑制;在肺癌中的表達形式類似于胚肺生長中所見，這種表達形式在蛋白質和信號分子水平是一致的，表明hnRNP A2/B1可能是一種癌生長蛋白。

本研究表明，在Ⅰ～Ⅱ期肺癌組織與外周血單個核細胞中hnRNP A2/B1 mRNA均高于良性組，提示肺癌早期已出現hnRNP A2/B1異常表達，有助于肺癌的早期診斷，與相關報道一致［6，7］;肺癌組患者癌組織與外周血單個核細胞的hnRNP A2/B1表達呈正相關(r=0.941，P ＜0.05)，其原因為早期肺原發灶腫瘤生長代謝過程中因細胞壞死釋放hnRNP A2/B1 mRNA入血，且肺部血液循環非常豐富，hnRNP A2/B1 mRNA很快隨著血液循環到達全身。因此，檢測外周血單個核細胞hnRNP A2/B1即可反應病變組織中該因子的變化，可作為一種有助于NSCLC的早期診斷及病理分期的腫瘤標志物。此外，外周血標本容易獲取，創傷較小，且PT-PCR技術相對于現今復雜的分子技術而言操作和硬件設備要求相對簡單，一般三甲醫院臨床實驗室均有檢測條件，因此對疑似NSCLC患者早期檢測外周血單個核細胞中的hnRNP A2/B1基因具有臨床可行性［8～10］。

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