全身熱應激預處理對大鼠腸缺血—再灌注損傷程度的影響及機制

王丹妹，何 佟，吉麗敏，翁 陽，莫燕娜

(海南醫(yī)學院，海口571101)

研究證明經典的熱應激預處理(42℃)可誘導熱休克蛋白(HSP)表達增加，對腸缺血—再灌注損傷(IR)有保護作用［1］。但其他溫度熱應激預處理腸IR的影響尚不明確。2010年7月～2011年12月，我們觀察并比較了38.5～39℃、40～40.5℃、41.5～42℃全身熱應激預處理后大鼠腸黏膜HSP水平、Caspase-3活性及腸黏膜細胞凋亡情況。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SD雄性大鼠50只，體質量200～230 g，購自于河南省實驗動物中心，隨機分為5個組。A組為正常體溫+假手術對照組，B組為正常體溫+腸IR組;C組為38.5～39℃熱應激+腸IR組，D組為40～40.5℃熱應激+腸IR組，E組為41.5～42℃熱應激+腸IR組。

1.2 試劑與設備 鼠抗誘導型HSP70(HSP72) mAb(SPA-810)(美國Stressgen公司);鼠抗β-actin mAb(南京建成生物工程研究所提供);DAB顯色試劑(武漢博士得生物工程公司);細胞凋亡原位末端標記法(TUNEL)試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司);Caspase-3 Colorimetric Assay(購自美國R＆D公司)。Stat Fax-2100型酶標儀(美國AWARENESS);光學顯微鏡(日本Olympus)。

1.3 全身熱應激預處理方法 大鼠用3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg體質量)腹腔注射麻醉。C組置于45℃恒溫水浴箱中，使其肛溫在20 min內達到38.5～39℃，然后移至事先已經調溫好的39℃水浴箱中并維持10 min;D組置于50℃恒溫水浴箱中，使肛溫20 min內達到40～40.5℃，維持10 min;E組置于55℃恒溫箱中，使肛溫在20 min內升至41.5～42℃，維持10 min，取出置室溫24 h;A組和B組不進行熱應激預處理。

1.4 大鼠腸缺血—再灌注損傷模型制作方法 大鼠預先禁食12 h，但可自由飲水。用3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg體質量)進行腹腔注射麻醉。取正中切口，分離出腸系膜上動脈(SMA)，室溫靜置10 min。B、C、D、E組用微動脈夾夾閉系膜上動脈，30 min后輕輕取出動脈夾，自然恢復血液重新灌流。A組只分離但不夾閉SMA。

1.5 腸道組織形態(tài)學觀察方法 自然恢復血液再灌注60 min及相應時點，從腸道回盲部近端距回盲瓣10 cm處剪取約2 cm長度的小腸標本，放入盛有中性甲醛溶液中固定，備以后做常規(guī)病理切片用，用HE染色方法進行染色，觀察腸組織形態(tài)學變化。

1.6 腸黏膜HSP72水平、Caspase-3活性、細胞凋亡率檢測方法 從距回盲瓣12 cm處截取約3～4 cm長度的小腸，置預冷的生理鹽水中，縱向剖開，輕柔漂洗2～3次，然后刮取腸黏膜置于EP管中，放置－80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩＂貶SP72水平。采用Western Blot法。提取腸黏膜蛋白，考馬斯亮藍(Bradford)法進行蛋白定量。采用Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺(100 g/L)凝膠進行電泳，電泳后轉至PVDF膜上，以20 g/L牛血清白蛋白封閉后，一抗封閉4 h以及辣根過氧化物酶標記的二抗封閉1 h，以β-actin作為內對照，DAB顯色。采用Scion Image軟件進行計算HSP72的灰度值與β-actin的灰度值，檢測各樣本中HSP72表達水平(即HSP72灰度值/β-actin灰度值)。②細胞凋亡率。采用原位末端缺口標記法(TUNEL)。操作按試劑盒說明書進行。在高倍顯微鏡下見胞核呈棕褐色的細胞為凋亡細胞。隨機計數(shù)5個高倍視野內凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，細胞凋亡率 =凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù) ×100%。③Caspase-3活性。采用比色法。操作嚴格按試劑盒說明書進行。用Stat Fax-2100型酶標儀讀取各孔吸光度值(波長為405 nm)，計算出樣本的Caspase-3活性值(即樣本孔的吸光度值－對照孔的吸光度值)。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。結果以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腸道組織形態(tài)學變化 B組見有固有層破壞，出血;C組損傷程度比B組輕，見部分絨毛頂端破損;D、E組腸黏膜損傷程度更輕，僅出現(xiàn)絨毛頂端上皮下間隙增大或絨毛輕度水腫。

2.2 腸黏膜HSP72水平 A、B、C、D、E組大鼠腸黏膜組織HSP72水平分別為0.40±0.09、0.26± 0.09、1.08±0.11、1.39±0.23、2.72±0.88。C、D、E組腸黏膜組織HSP72水平高于A、B組(P均＜0.05);E組腸黏膜組織HSP72水平明顯高于C、D組(P均＜0.05)。

2.3 腸黏膜上皮細胞凋亡率 A、B、C、D、E組大鼠腸黏膜組織細胞凋亡率分別為4.60%±1.12%、35.53% ±3.40%、21.10% ±3.11%、7.50% ± 1.88%、6.60%±1.83%。腸黏膜細胞凋亡率D、E組比B組降低(P均＜0.05);C組與B組相比雖數(shù)值略有降低，但P＞0.05;D、E組相比，P＞0.05。

2.4 腸黏膜Caspase-3活性 A、B、C、D、E組大鼠腸黏膜組織 Caspase-3活性分別為1.22±0.14、2.72±0.55、1.33±0.24、1.41±0.30、1.16±0.30。C、D、E組大鼠腸黏膜組織Caspase-3活性與B組相比明顯降低(P均＜0.05)，D組與E組、D組與A組、E組與A組相比，P均＞0.05。

3 討論

從最簡單的原核生物到復雜的生物體乃至人類，各種應激因素都會誘導細胞內保護性分子HSP的表達增加［2，3］。目前的研究表明，HSP是一組非特異性細胞保護蛋白，具有多種功能。因應激誘導機體表達熱休克蛋白，可以耐受其他不利因素對機體細胞的損傷［4］。誘導型HSP(HSP72)可以作為應激反應的標志，是HSP中最受關注的一種［5］。

本研究中我們用不同溫度(39、40、42℃)對大鼠進行不同強度的全身熱應激處理，檢測腸黏膜HSP72的表達，結果發(fā)現(xiàn)不同強度熱應激處理，均能誘導HSP72蛋白表達水平增加，在3個溫度范圍內，呈現(xiàn)隨著處理溫度的升高腸黏膜HSP72蛋白表達水平增加的線性改變，以E組最顯著。實驗結果與在人A549肺內皮細胞中的觀察結果一致［6］。

腸IR是臨床常見的各種組織器官損傷之一，在腸移植、嚴重創(chuàng)傷、感染、應激等疾患的病理演變過程中起重要作用［7］。目前認為腸IR與細胞凋亡密切相關［8］。本研究中筆者通過夾閉—松開腸系膜上動脈的方法復制腸IR模型，結果顯示IR組腸黏膜上皮細胞凋亡率和Caspase-3活性值顯著增高，說明成功建立了腸IR模型。

本研究結果顯示，經全身熱應激處理的大鼠在IR后腸黏膜形態(tài)學的改變較未經熱處理組有不同程度的減輕，腸黏膜上皮細胞凋亡指數(shù)和腸黏膜細胞Caspase-3活性也呈現(xiàn)不同程度的下降，以D、E組改善明顯。表明不同強度的全身熱應激處理對腸IR均有保護作用，這種保護效應與熱應激誘導HSP72蛋白的表達水平有關。與以往的研究結果［7］一致。以往的研究認為可誘導性HSP的表達增加可增強細胞抗凋亡作用［10］。HSP70能抑制通過Fas傳導通路誘導的Caspase-3、8的活化而防止細胞凋亡［11］。HSP72的保護效應體現(xiàn)在對凋亡上游通路的阻斷［12～15］。此外本研究結果顯示，D、E組大鼠腸黏膜形態(tài)學、細胞凋亡率和Caspase-3活性差異不大，這是否提示腸黏膜HSP72的表達達到一定水平即達到最大的保護效應，其機制還有待進一步研究闡明。

［1］莫燕娜，吉麗敏，王丹妹，等.熱應激預處理對大鼠腸缺血—再灌注損傷的保護效應［J］.世界華人消化雜志，2007，15(35): 3703-3709.

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