VEGFsiRNA、bFGFsiRNA對胰腺癌細胞bFGF mRNA、蛋白表達的影響

閆長青，趙玉沛，劉三光，戚 誠，張建生，王文斌

(1河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，石家莊050011;2中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院)

胰腺癌細胞是血管生成因子重要來源，胰腺癌細胞同時產(chǎn)生多種血管生成因子，血管生成因子表達水平可能與胰腺癌細胞增殖與侵襲密切相關［1，2］，血管生成因子之間特別是VEGF與bFGF的表達可能存在相互調節(jié)［3，4］。2011年3～6月，我們分別用VEGFsiRNA及bFGFsiRNA轉染胰腺癌細胞株sw1990、PCT-3及Panc-1，觀察VEGFsiRNA和bFGFsiRNA對胰腺癌 sw1990、Panc-1及 PCT-3細胞bFGF表達水平的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胰腺癌細胞株sw1990、Panc-1、PCT-3由北京協(xié)和醫(yī)院基本外科實驗室保存。VEGFsiRNA、bFGFsiRNA、control siRNA(Fluorescein Conjugate)及siRNA Transfection Medium購自美國SANTA CRUZ公司(sc-36868);siRNA Transfection Reagent Lipofectamine2000及總RNA提取試劑購自美國Invertrogen公司;bFGF ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 siRNA轉染胰腺癌細胞株 先參照文獻［2］方法進行預試驗觀察轉染效率。將細胞接種于6孔板，每孔2×105個細胞，加入2 mL含10%胎牛血清的無抗生素RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)至細胞60%～80%融合。將VEGFsiRNA、bFGFsiRNA復合物和Lipofectamine2000分別溶解與100 μL siRNA Transfection Medium。然后輕輕混合，在室溫下孵育30 min。取轉染復合物0.2 mL加0.8 mL的siRNATransfection Medium，混勻加入洗滌后的sw1990、Panc-1、PCT-3細胞。37℃、CO2培養(yǎng)箱孵育6 h;10 000 r/min離心。

1.2.2 bFGF mRNA檢測 采用RT-PCR法檢測sw1990、Panc-1、PCT-3細胞中的bFGF mRNA。先參照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA。逆轉錄合成cDNA后行PCR擴增:引物由上海生工生物技術有限責任公司合成。引物序列:bFGF:5'-AGCGGCTGTACTGCAAAAAC-3'，5'-CCCAGGTCCTGTTTTGGAT-3'。β-actin:5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'，5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。紫外燈下照相并分析。相對表達量(A)=A目的基因/Aβ-actin。

1.2.3 bFGF蛋白檢測 采用ELISA法檢測上清液中的bFGF蛋白。操作按試劑盒說明書進行。結果以450 nm處OD值表示。所有檢測樣本重復兩次，以OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標本樣品的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。組間比較采用采用方差分析和t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 bFGF mRNA VEGFsiRNA處理后 PCT-3、Panc-1、sw1990細胞bFGF mRNA相對表達量分別為0.50±0.05、0.81±0.09、0.46±0.06，bFGFsiRNA處理后分別為0.08±0.01、0.10±0.04、0.15± 0.08，對照組分別為0.42±0.02、0.62±0.03、0.22 ±0.03。VEGFsiRNA處理后Panc-1、sw1990細胞bFGF mRNA表達強于對照組(P均＜0.05)，VEGF-siRNA處理后PCT-3細胞bFGFmRNA表達與對照組相比P＞0.05。bFGFsiRNA處理后PCT-3、Panc-1細胞bFGF mRNA表達弱于對照組(P均＜0.05)，bFGFsiRNA處理后sw1990細胞bFGF mRNA表達與對照組相比P＞0.05。

2.2 bFGF蛋白 VEGFsiRNA處理后PCT-3、Panc-1、sw1990細胞培養(yǎng)液上清液 bFGF蛋白濃度為(490.57±125.23)pg/mL、(77.49±10.07)pg/mL、(13.35±1.63)pg/mL，bFGFsiRNA處理后分別為(142.78±13.95)pg/mL、(11.41±8.14)pg/mL、(2.26±0.65)pg/mL，對照組分別為(316.29± 57.39)pg/mL、(36.44±12.29)pg/mL、(3.87± 0.42)pg/mL。VEGFsiRNA處理后sw1990、Panc-1細胞培養(yǎng)液上清液中bFGF濃度較對照組顯著升高(P均＜0.05)，PCT-3細胞培養(yǎng)液上清液bFGF濃度與對照組相比P＞0.05。bFGFsiRNA處理后PCT-3、Panc-1、sw1990細胞培養(yǎng)液上清液中bFGF濃度較對照組顯著降低(P均＜0.05)。

3 討論

新生血管生成是實體腫瘤進展和遠處轉移的基礎，血管生成激活及調節(jié)受控于促/抑血管生成因子的相互作用［5］。不同的血管生成因子在各種腫瘤進展中對新生血管的調節(jié)作用已經(jīng)得到了廣泛的研究和認同，抗血管治療是最重要的抗腫瘤治療策略之一［6］。腫瘤血管形成是多種血管生成因子共同作用的結果，VEGF及bFGF是最重要的促血管生成因子，與胰腺癌進展及預后關系密切。血管生成因子之間可能存在相互調節(jié)作用。本研究結果顯示，bFGFsiRNA抑制胰腺癌細胞bFGF mRNA、蛋白表達，bFGFsiRNA抑制胰腺癌細胞bFGF mRNA、蛋白表達;VEGFsiRNA上調胰腺癌細胞bFGF mRNA、蛋白表達。前期研究證實bFGF在胰腺癌細胞內表達顯著高于細胞外，VEGF在胰腺癌細胞外表達顯著高于胞內，由此推斷bFGF可能在胰腺癌細胞內發(fā)揮重要的調節(jié)作用，VEGF則可能更多地在胰腺癌細胞微環(huán)境方面發(fā)揮作用［3］。多數(shù)學者認為bFGF能夠誘導VEGF分泌，上調VEGF表達［7，8］。Fontijn等［8］研究證實bFGF過度表達上調黑色素瘤細胞VEGF分泌從而促進腫瘤血管形成和侵襲，這一過程是通過PI-3K及p38 MAPK途徑完成的。因此可以推斷，胰腺癌細胞在VEGFsiRNA轉染后VEGF表達受到抑制，可能通過反饋調節(jié)影響到bFGF表達，胰腺癌細胞可能在轉錄水平通過上調bFGFmRNA表達促進VEGF表達及細胞外bFGF表達，進而完成其腫瘤細胞侵襲及血管生成等生物學特性，其調節(jié)通路尚需進一步研究。

胰腺癌細胞血管生成因子分泌的復雜的相互調節(jié)關系是與其腫瘤生物學特性相適應的，與腫瘤進展密切相關。VEGF及bFGF在胰腺癌發(fā)生、進展、轉移的過程中發(fā)揮各自腫瘤生物學作用的同時存在重要的相互調節(jié)作用，進而推斷參與胰腺癌發(fā)生、進展、轉移全過程的血管生成因子之間可能存在復雜的相互影響作用，因此有必要進一步深入的探討其相互調節(jié)機制，從而為胰腺癌及其他腫瘤的抗血管治療提供完善的治療靶點。在制定抗血管生成治療策略時，針對不同靶標的聯(lián)合治療可能會獲得更好的治療效果，而深入研究探討其調節(jié)機制可能會進一步提高聯(lián)合治療效果。同時也應注意到本研究中不同的細胞株血管生成因子表達之間的相互關系不盡相同，因此制定聯(lián)合抗血管治療方案同時還應考慮治療個體化及與其他治療方法協(xié)同的問題。

［1］閆長青，趙玉沛，戴夢華，等.胰腺癌患者外周血促血管生成因子濃度與疾病進展的關系［J］.中華外科雜志，2007，45(7):496-498.

［2］戴夢華，閆長青，趙玉沛，等.胰腺癌患者外周血抑血管生成因子濃度與疾病進展的關系［J］.中華外科雜志，2007，45(17):1199-1201.

［3］閆長青，趙玉沛.血管生成因子VEGF、bFGF、endostatin在胰腺癌細胞中的表達［J］.中華外科雜志，2009，47(10):787-790.

［4］閆長青，趙玉沛.VEGFsiRNA及bFGFsiRNA對胰腺癌細胞增殖和侵襲性的影響［J］.中華外科雜志，2010，48(8):610-614.

［5］Jain RK.Normalization of tumor vasculature:an emerging concept in antiangiogenic therapy［J］.Science，2005，307(5706):58-62.

［6］Eichholz A，Merchant S，Gaya AM.Anti-angiogenesis therapies: their potential in cancer management［J］.Onco Targets Ther，2010，(3):69-82.

［7］Kuhn H，Konrada J，Holtzb S，et al.Enhanced expression of VEGF following bFGF inhibition in non-small cell lung cancer cell lines［J］.Lung Cancer，2006，54(2):149-153.

［8］Fontijn D，Bosch LJ，Duyndam MC，et al.Basic fibroblast growth factor-mediated overexpression of vascular endothelial growth factor in 1F6 human melanoma cells is regulated by activation of PI-3K and p38MAPK［J］.Cell Oncol，2009，31(3):179-190.