萊姆病的實驗室檢查與診斷

楊清銳，于成成，楊杏林

(山東大學附屬省立醫(yī)院，濟南 250021)

萊姆病(LD)是一種由伯氏螺旋體(Borrelia burgdorferi)感染引起的全身慢性傳染病。伯氏螺旋體分為10個基因型，具致病性的3個基因型分別是伯氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體(Borrelia garinii)及阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)。北美流行的病原體主要是伯氏疏螺旋體，亞、歐洲則以伽氏疏螺旋體和阿氏疏螺旋體為主。

1 伯氏螺旋體實驗室檢查

伯氏疏螺旋體是單細胞疏松盤繞的左旋螺旋體，由表層、外膜、鞭毛和原生質(zhì)柱四部分構(gòu)成。其基因組由一個線狀910 kb染色體和20多個5～56 kb的線狀、環(huán)狀質(zhì)粒組成。鞭毛蛋白基因位于線狀染色體，編碼具有高度保守性的336個氨基酸序列，相對分子質(zhì)量為41 ku，其肽鏈中央?yún)^(qū)域氨基酸組成為種特異性抗原表達位點，也是LD血清學診斷的抗原標志。OspA和OspB基因位于線狀質(zhì)粒，OspC基因位于環(huán)狀質(zhì)粒，亦是LD的主要抗原性外膜蛋白。伯氏螺旋體實驗室檢查主要分為病原體檢測、血清學檢測和分子生物學檢測。

1.1 病原學檢測 ①病原體直接鏡檢:LD患者血液、腦脊液、關(guān)節(jié)液、尿液等體液涂片可直接置于顯微鏡暗視野下鏡檢。游走性紅斑、關(guān)節(jié)滑膜或淋巴結(jié)等組織活檢切片則需經(jīng)品紅法等染色處理后鏡檢。此種常規(guī)的直接鏡檢法較為可靠，但受樣本低含菌量限制易漏診、病原體檢出率極低，如能加做直接熒光抗體染色檢查或可提高檢出率。②病原體分離培養(yǎng):采集LD患者血液、腦脊液、關(guān)節(jié)液等體液或組織標本加入MPK培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離病原體并置于顯微鏡暗視野下鏡檢是診斷LD的“金標準”。但受伯氏疏螺旋體菌量少、培養(yǎng)周期長、實驗操作條件要求嚴格、部分患者已進行抗生素治療等因素影響，本法難以在臨床常規(guī)開展。

1.2 血清學檢測 LD血清學檢測常用方法包括間接免疫熒光試驗(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫蛋白印跡試驗(Western bloting)等。目前國際上通用兩步法診斷 LD，第一步采用IFA法或ELISA檢測抗體，第二步采用Western bloting對陽性標本進行驗證。①IFA試驗:IFA法是最早應用于LD檢測的血清學方法。靶抗原采用伯氏疏螺旋體的顆粒性抗原。我國和歐洲多采用的陽性結(jié)果判斷標準如下:IFA檢測單份血清如lgM抗體滴度≥1∶64、lgG抗體滴度≥1∶128，或檢測雙份血清抗體滴度大于4倍。本法操作簡便易行，結(jié)果較為可靠。②ELISA:ELISA法試劑靶抗原包括B31菌株全菌超聲波勻漿抗原、重組外膜蛋白抗原100 ku、41 ku及OspA、OspC等。其中，全菌抗原試劑因成分特異性不高，與梅毒螺旋體、鉤端螺旋體等其他種屬螺旋體存在交叉反應而逐漸被臨床淘汰。純化后的重組外膜蛋白抗原可一定程度上提高實驗敏感性和特異性，優(yōu)于IFA試驗。ELISA法可檢測出大多數(shù)LD急性期病例。另外，有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)LD患者腦脊液中抗LD抗體陽性檢出率和滴度均高于血清，且腦脊液中的高滴度抗體提示神經(jīng)鞘內(nèi)存在著活躍的感染。③免疫蛋白印跡試驗:此法因可分離不同的蛋白質(zhì)并鑒定其相對分子質(zhì)量大小而多被用于檢測伯氏疏螺旋體特異性蛋白抗體，主要用于確認試驗。2004年中國疾病預防控制中心(CDC)傳染病預防控制所針對基因型伽氏疏螺旋體制定的標準如下:OspA、OspC、17 kD、30 kD、39 kD、58 kD、66 kD、83/100 kD中至少有一條蛋白帶顯色即可診斷IgG 陽性。OspA、OspC、17 kD、30 kD、14 kD、58 kD、83/100 kD中至少有一條蛋白帶顯色可診斷IgM陽性，41 kD顯色者則須進一步作梅毒螺旋體和鉤端螺旋體的鑒別診斷。

一般來說，分析上述血清學檢查結(jié)果需注意以下幾點:①LD感染早期或伴有免疫抑制患者可呈抗體檢測陰性。②臨床抗生素濫用致抗體檢測陽性率降低。③可能和梅毒、鉤端螺旋體、回歸熱等感染患者出現(xiàn)交叉反應而呈假陽性。④部分LD現(xiàn)癥者及既往感染者難以區(qū)分。因此，臨床應對LD患者血清進行雙份(甚至動態(tài))抗體滴度檢測。

1.3 分子生物學檢測 ①聚合酶鏈反應(PCR):本法多取用LD患者體液及皮膚、關(guān)節(jié)滑膜等受累臟器進行伯氏疏螺旋體特異性核酸片段檢測。主要檢測靶基因包括鞭毛蛋白p66編碼基因、OspA編碼基因、OspB編碼基因、16S rRNA基因和5S/23S rRNA間隔基因區(qū)等。PCR法具有快速方便、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。但本法有兩點值得注意:一是PCR法的高敏感性對存在微量交叉污染的標本容易出現(xiàn)假陽性;二是PCR可從死菌中擴增DNA，其陽性結(jié)果并不一定提示有活菌感染。②反向線點雜交技術(shù)(Reverse line blot，RLB):本法主要檢測靶基因是伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列，設計兩對引物，其中一對引物的一條鏈用生物素標記，PCR擴增后再與設計的單鏈種特異性寡核苷酸探針進行雜交反應。此法具有高特異性和高敏感性。

2 LD診斷

LD的診斷需要根據(jù)流行病學資料、接觸史、臨床癥狀及實驗室檢查結(jié)果綜合分析判斷。目前臨床多采用美國疾病控制中心提出的LD診斷標準，即符合下列任何1條者均可診斷為LD:①在流行區(qū)，有慢性游走性紅斑(單個紅斑的直徑必須至少為5 cm，并應由醫(yī)生檢查確定)或抗伯氏疏螺旋體抗體滴度≥1∶256，及1個或1個以上器官系統(tǒng)受累。②在非流行區(qū)，有慢性游走性紅斑及抗伯氏疏螺旋體抗體滴度≥1∶256，或有慢性游走性紅斑及1個或1個以上器官系統(tǒng)受累，或抗體滴度≥1∶256及1個或1個以上器官系統(tǒng)受累。