體外循環再灌注血清對人腎小管上皮細胞的損傷作用

賴前成，鄧永花，萬居易，伍長學，王 波，廖 斌

(1瀘州醫學院附屬醫院，四川瀘州646000;2成都市第二人民醫院)

急性腎功能衰竭(AKI)是心臟手術后最常見的并發癥之一，體外循環是目前心臟外科心內直視手術不可避免的復雜的病理生理過程，復雜的管道系統、體外循環轉機時間、灌注流量和壓力、灌流模式等多種因素可導致患者術后發生腎功能損傷［1］。動物實驗或者已有的缺氧復氧細胞培養模型均無法真實模擬這種復雜的環境。為此，本研究2009年12月～2010年12月通過改良細胞培養模型，采用體外循環再灌注血進行人近曲腎小管上皮細胞(HK-2)缺血再灌注損傷研究，并初步分析可能的分子機理，為進一步研究防治體外循環后腎小管細胞損傷奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人HK-2引自ATCC(American Type Culture Collection);DMEM(GIBCO);胰酶(OXODI);胎牛血清(成都哈里公司);Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒(北京中杉金橋公司); SP-9000免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋公司);多聚賴氨酸，DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司);其余試劑均為市售分析純。實驗在我院中心實驗室實施。

1.2 方法

1.2.1 HK-2細胞株的復蘇、培養、傳代 從液氮罐中取出凍存的HK-2細胞投入37℃的溫水中，搖動使其盡快解凍。吸出細胞懸液并滴加10倍體積的質量分數為10%的胎牛血清的DMEM培養基，混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清液后再重復洗滌1次。用含10%的胎牛血清的DMEM培養液將細胞懸液稀釋混勻，接種于100 mL培養瓶中，37℃下5%CO2細胞培養箱中靜置12 h，換液除去未貼壁細胞后至細胞長滿成片 80%以上。用濃度為0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。

1.2.2 正常人體外循環再灌注血清的制備 ①隨機采集5例健康志愿者外周血約5 mL，立即在4℃離心機1 500 r/min離心15 min，收集上清，－20℃保存備用。②隨機選取我科5例體外循環手術主動脈阻斷時間在60 min以上患者，于開放主動脈1 h后采集患者外周血，立即在4℃離心機1 500 r/min離心15 min，收集上清，－20℃保存備用。

1.2.3 腎小管上皮細胞缺血再灌注模型的建立①培養腎小管上皮細胞的缺血模擬:100%N2飽和無糖無機鹽緩沖液40 min，吸棄6孔板及培養瓶內的細胞培養基，用無糖無機鹽緩沖液沖洗，加入100%N2飽和無糖無機鹽緩沖液，置95%N2+5% CO2環境培養2 h。②培養腎小管上皮細胞的再灌注模擬及分組:吸棄6孔板及培養瓶內無糖無機鹽緩沖液后，實驗組加入含10%體外循環再灌注血清的DMEM低糖培養基，置95%O2+5%CO2環境培養4 h。對照組以正常人血清代替再灌注血清，空白組不含血清。處理后的6孔板內的腎小管上皮細胞用于免疫細胞化學法(ICC)檢測。培養瓶內的腎小管上皮細胞消化離心洗滌后用于流式細胞儀測定細胞凋亡。

1.2.4 細胞凋亡檢測分析 Anexin V/PI染色:胰酶消化細胞，PBS清洗2次，加入適量的熒光標記的Annexin V試劑和PI，混勻后避光室溫下孵育15 min，孵育后加入400 μL染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析并記錄結果。

1.2.5 Caspase-3蛋白表達檢測 按試劑盒說明書操作，采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白(Streptavidin/Peroxidase，SP)染色的免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達。

1.2.6 圖像分析及統計學方法 圖像分析采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統統計積分光密度(IOD)值。實驗數據均以±s表示，顯著性檢驗應用單因素方差分析在SPSS13.0統計軟件包完成。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測結果顯示，體外循環血清處理后，腎小管上皮細胞出現了凋亡，實驗組凋亡率(38.96% ±9.70%)高于對照組(29.83%±8.76%)和空白組(28.76%±7.38%)，P＜0.05。對照組與空白組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 Caspase-3免疫組化檢測 實驗組Caspase-3蛋白的IOD值(99.87±20.38)高于對照組(63.57 ±19.83)及空白組(60.58±15.74)，P＜0.05;對照組與空白組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見插頁Ⅰ圖9。

3 討論

體外循環心臟手術后AKI的發生率為20%～30%，其腎損害輕重不一［2］。動物實驗證實體外循環并發AKI主要原因是腎小管損傷［3］，其致病因素較復雜，包括缺血再灌注損傷及全身炎癥介質，常常是綜合性因素所致［4］。Turkmen等［5］通過動物實驗缺血再灌注損傷模擬體外循環對腎小管細胞損傷作用，觀察到腎小管細胞的壞死、凋亡等變化。也有通過腎小管細胞缺氧復氧培養來研究腎小管細胞的損傷作用［6］。然而，體外循環不僅僅是腎臟在體外循環時受到缺血再灌注損傷，還包括全身多個器官，多種炎癥介質在開放升主動脈后參與對腎小管細胞的損傷作用［4］，但目前全面真實的模擬體外循環手術后對人近端腎小管上皮細胞損傷的研究還較少。為此本實驗采用心臟體外循環手術后血清為研究對象，能較全面真實模擬上述因素對人腎小管的損傷作用。

已有實驗證據支持凋亡在AKI中的致病作用，而且認為HK-2細胞對凋亡高度敏感，對整個器官衰竭具有重要作用［7］。本實驗通過AnnexinV-FTTC/PI標記流式細胞分析法分析了各組腎小管細胞凋亡早期細胞膜的重排，從而可敏感發現體外循環后對腎小管細胞的早期損害。實驗組較對照組、空白組凋亡率明顯增高，說明體外循環血清對人腎小管上皮有致凋亡作用。隨著對在AKI中腎細胞死亡機制的認識，將產生新的治療靶點［7］。

Caspase-3是凋亡執行的重要效應分子，是凋亡發生的關鍵效應酶。其表達的增加、激活是凋亡信號轉導路徑中的關鍵環節，是凋亡啟動過程中的早期事件，是參與調節和執行細胞凋亡最重要的蛋白酶之一［8］。細胞凋亡的主要細胞信號通路有Caspase依賴的通路和非 Caspase依賴的通路［9］。本研究實驗組較對照組及空白組Caspase-3蛋白表達明顯增高，這可能激活了依賴Caspase凋亡信號通路，致人腎小管上皮細胞凋亡。

本實驗較真實的模擬了體外循環后各種致病因素，采用人腎小管細胞作為研究對象，直接觀察到體外循環術后對人腎小管細胞的損傷作用。從而在細胞水平為研究保護術后腎臟損害提供了一種較真實可信的方法。

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