乳腺癌組織中Nup88、PINCH mRNA表達與HER-2的相關性研究

江建軍，田延鋒，趙增仁，李 芳，劉 擘，賀新奇，劉 博，張麗凈

(1河北省人民醫院，石家莊050031;2河北醫科大學第一醫院)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，據國際癌癥研究機構2008年發布的報告，在全世界女性癌癥患者中乳腺癌占22.9%，因乳腺癌死亡45 8503例(病死率13.7%)，嚴重危害女性健康。乳腺癌有多個治療、預后指標，近10 a HER-2在標準乳腺癌治療中已成為公認的治療指標［1］。許多研究表明Nup88、PINCH mRNA與多種腫瘤的發生發展密切相關［2，3］，但有關 Nup88、PINCH mRNA表達與HER-2的關系的研究少見報道。本文旨在探討乳腺癌中Nup88、PINCH mRNA的表達與HER-2的關系，以進一步了解三者在乳腺癌發生、發展及轉移過程中的相互作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集河北醫科大學第一醫院及河北唐山工人醫院2008年11月～2010年2月乳腺癌患者40例(術前均冰凍病理證實為乳腺癌)，均為女性，年齡26～75歲、平均58.5歲。病變標本離體半小時內取乳腺癌組織0.1 g，立即置入液氮罐速凍，迅速保存于－80℃冰箱，用于RT-PCR檢測。

1.2 Nup88、PINCH mRNA檢測方法 采用RTPCR法。取組織標本0.1 g置于無RNA酶的勻漿器中，快速加入1 mL Trizol裂解液，冰浴中勻漿，轉移至離心管，每管加入氯仿200 μL，劇烈震蕩3 min，靜置5 min后在12 000 rpm、4℃條件下離心15 min。取上清液轉移至1.5 mL Eppendorf(EP)管中，然后滴加等量的異丙醇，緩慢顛倒混勻至分層消失，并于－70℃沉淀2 h，在13 000 rpm、4℃條件下離心15 min。棄上清，沉淀物用1 mL 75%乙醇洗1次，在4℃7 500 rpm離心5 min，棄上清，置4℃冰箱，待干燥后溶于去離子水中，－80℃冰箱中備用。在紫外分光光度儀上測量260 nm(OD260)和280 nm (OD280)兩個波長的吸光度(OD260/OD280大于1.8)。在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳(恒壓80 V、電泳緩沖液1×TBE)30 min后，將凝膠移至紫外透射儀下進行觀察，有兩條完整清晰的RNA電泳條帶，即28 S和18 S，且28 S的亮度和寬度是18 S的兩倍，說明總RNA無降解。取2 μg RNA 37℃反轉錄60 min，得到cDNA。用primer5軟件設計PINCH、Nup88的引物序列，以管家基因β-actin作為內參照。反應條件:94℃預變性5 min，94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃30 s，30個循環，72℃延伸10 min。將6 μL擴增產物與2 μL溴酚藍上樣緩沖液混合，在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，恒壓80 V，30 min后用凝膠成像系統觀察結果，在相應位置上可見清晰特異的268 bp(Nup88)的條帶，置紫外燈下拍照后進行面積灰度掃描。Nup88 mRNA的相對表達量=Nup88產物吸光度值/β-actin產物吸光度值。

1.3 HER-2結果判斷 HER-2蛋白過表達評估: (－)指無著色或不到10%腫瘤細胞膜著色;(+)指超過10%腫瘤細胞有微弱的或略能辨認的膜著色，僅部分細胞膜著色;(++)指超過10%腫瘤細胞可見微弱至中等的完全膜著色;(+++)指超過10%腫瘤細胞可見強而完全的膜著色。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，計量資料用±s表示，Nup88、PINCH mRNA表達和HER-2相關性采用Spearman相關性分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Nup88、PINCH mRNA和HER2在乳腺癌組織中的表達 Nup88 mRNA在乳腺癌中的表達水平為0.575±0.230;PINCH mRNA在乳腺癌中的表達水平為0.875±0.470;HER-2蛋白表達為(－)20例，(+)8例，(++)5例，(+++)7例。

2.2 Nup88、PINCH mRNA表達與HER-2的相關性Nup88 mRNA表達與HER-2相關性無統計學意義，但具有正相關趨勢，r=0.30、P=0.062;PINCH mRNA表達與HER-2相關性亦無統計學意義，但具有正相關趨勢，r=0.31、P=0.054。

3 討論

HER-2基因(又稱C-erbB-2)是一種原癌基因，其在乳腺癌中表達高達20%，并且與侵襲性亞型相關［4］。HER-2陽性往往伴隨著其他不良預后因素，如高TNM分期、腋窩淋巴結轉移、ER和(或)PR陰性以及原發腫瘤生長迅速、分化差等［5］。HER-2基因擴增是有效預測總生存率和乳腺癌患者復發的重要因素，可影響激素、細胞毒藥物和放療的敏感性［6］。目前認為該特性與Her-2受體能激活其下游信號傳導通路有關，其介導的信號轉導通路主要包括以下幾種:Ras-Raf-Mek-MAPK、PI3K-Akt激酶和cAMP(蛋白激酶A)等［7］。HER-2過度表達可促進細胞的有絲分裂，抑制細胞凋亡，促進腫瘤新生血管生成［8］。

核孔復合物是細胞核與細胞質之間物質與信息交換的通道［9］，在基因激活中發揮重要作用［2］，由30余種核孔蛋白組成。Nup88是一種非苯甘氨酸核孔蛋白存在于核孔復合體的細胞質面［9］。近幾年研究表明，Nup88與腫瘤發生、發展密切相關。Gould等［2］應用免疫組化及免疫印跡法對214例組織(包括惡性腫瘤、良性腫瘤、異型增生組織及相應正常組織)進行分析，免疫組化結果發現，惡性腫瘤均為染色陽性，包括肉瘤、黑色素瘤、膠質瘤、淋巴腫瘤、乳腺癌、結腸癌、胃癌和前列腺癌。而Nup88與Nup214一同附著于紡錘體上參與有絲分裂，影響細胞周期［10］。HER-2亦可影響細胞有絲分裂。另外，David等［11］通過對122例乳腺癌組織的mRNA進行RT-PCR研究，發現Nup88 mRNA在乳腺癌中高表達，而Nup107則無高表達，而且在導管癌中Nup88 mRNA的表達明顯高于小葉癌;組織學分級3級的患者Nup88 mRNA的表達明顯高于1+2級;伴有淋巴結轉移者明顯強于無淋巴結轉移者。表明Nup88不僅與腫瘤發生發展有關，還與腫瘤的侵襲轉移相關。由此可見，在乳腺癌中Nup88與HER-2發揮類似作用。本實驗研究結果顯示兩者在乳腺癌組織的表達有正相關趨勢，提示它們在乳腺癌的發生發展及侵襲轉移過程中可能有協同作用。

PINGH最初是1994年Rearden通過篩選人類cDNA文庫尋找衰老紅細胞抗體時發現的。PINGH基因位于染色體2q12.2，編碼1個38 kDa蛋白［12］。PINCH蛋白是一種廣泛表達、在進化上保守的接頭蛋白，含有5個LIM結構域［13］。2002年Zhang等發現了 PINGH-2，并將之前的命名為 PINGH-1［14］。PINCH作為在腫瘤間質表達的少數蛋白中的一種，在腫瘤相關間質中的表達上調可能提示腫瘤的侵襲轉移能力增強［15］。Wang-Rodriguez等［3］通過對33例乳腺癌、22例前列腺癌、5例結腸癌、6例肺癌、8例皮膚癌進行免疫組化染色發現，PINCH在上述腫瘤相關間質成纖維細胞基質中呈強陽性表達，在腫瘤浸潤的邊緣表達最強烈，特別是在乳腺癌組織更為顯著，并且與腫瘤的侵襲和轉移有關。PINGH-1可以減緩多種類型的癌細胞凋亡［16］。PINGH-1發揮生物效應的直接獨立途徑:一是通過與ILK的相互作用，使細胞附著［17］，同時，調節TGF-1介導的上皮向間質轉化過程［18］;二是與 Ras抑制蛋白 1 (RSU-1)共同激活Rac-1，促進細胞擴散［17］。HER-2基因在乳腺癌中發揮生物效應也通過Ras基因，而且HER-2基因可促進腫瘤新生血管生成，對腫瘤的發展、侵襲、轉移發揮重要作用。本研究發現PINCH與HER-2在乳腺癌中的表達具有正相關趨勢。

綜上所述，Nup88、PINCH mRNA表達與HER-2在乳腺癌中的表達均具有正相關趨勢，可能隨著樣本量的增加，這種趨勢會更加明顯。這提示三者在乳腺癌的發生、發展及轉移過程中可能發揮一定的協同作用。但它們在功能上的確切關系及相互調節的機制尚不明確，有待于進一步研究。

［1］Higgins MJ，Baselga J.Targeted therapies for breast cancer［J］.J Clin Invest，2011，121(10):3797-3803.

［2］Gould VE，Martinez N，Orucevic A，et al.A novel，nuclear poreassociated，widely distributed molecule overexpressed in oncogenesis and development［J］.Am J Pathol，2000，157(5):1605-1613.

［3］Wang-Rodriguez J，Dreilinger AD，Alsharabi GM，et al.The signaling adapter protein PINCH is up-regulated in the stroma of common cancers，notably at invasive edges［J］.Cancer，2002，95(6): 1387-1395.

［4］Gajria D，Chandarlapaty S.HER2-amplified breast cancer:mechanisms of trastuzumab resistance and novel targeted therapies［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2011，11(2):263-275.

［5］王佳玉，徐兵河.HER-2和Top-Ⅱα可作為乳腺癌化療療效的預測因子［J］.臨床藥物治療雜志，2011，9(2):45-49.

［6］吳美華，馮震博.乳腺癌中HER-2、P16和P53的表達及預后意義［J］.當代醫學，2011，17(9):15-17.

［7］武露艷，姜秋穎，李里，等.VES對Her-2、p53共表達乳腺癌細胞的抑制作用及機制［J］.現代腫瘤醫學，2011，19(4):645-649.

［8］王佳妮，劉仁斌，梁惠珍，等.乳腺癌組織中HER2、ERα、ERβ、PR的表達及其相關性分析［J/CD］.中華普通外科學文獻(電子版)，2008，2(6):469-474.

［9］Xu S，Powers MA.Nuclear pore proteins and cancer［J］.Semin Cell Dev Biol，2009，20(5):620-630.

［10］Hashizume C，Nakano H，Yoshida K，et al.Characterization of the role of the tumor marker Nup88 in mitosis［J］.Mol Cancer，2010，(9):119.

［11］Agudo D，Gómez-Esquer F，Martínez-Arribas F，et al.Nup88 mRNA overexpression is associated with high aggressiveness of breast cancer［J］.Int J Cancer，2004，109(5):717-720.

［12］Sun XF，Zhang H.Clinicopathological significance of stromal variables:angiogenesis，lymphangiogenesis，inflammatory infiltration，MMP and PINCH in colorectal carcinomas［J］.Mol Cancer，2006，5:43.

［13］Tu Y，Li F，Goicoechea S，et al.The LIM-only protein PINCH directly interacts with integrin-linked kinase and is recruited to integrin-rich sites in spreading cells［J］.Mol Cell Biol，1999，19 (3):2425-2434.

［14］Zhang Y，Chen K，Guo L，et al.Characterization of PINCH-2，a new focal adhesion protein that regulates the PINCH-1-ILK interaction，cell spreading，and migration［J］.J Biol Chem，2002，277 (41):38328-38338.

［15］楊艷紅，朱振龍，楊文超.胃腺癌組織中PINCH、COX-2蛋白的表達變化及意義［J］.山東醫藥，2011，51(38):51-52.

［16］Chen K，Tu Y，Zhang Y，et al.PINCH-1 regulates the ERK-Bim pathway and contributes to apoptosis resistance in cancer cells［J］.J Biol Chem，2008，283(5):2508-2517.

［17］Ito S，Takahara Y，Hyodo T，et al.The roles of two distinct regions of PINCH-1 in the regulation of cell attachment and spreading［J］.Mol Biol Cell，2010，21(23):4120-4129.

［18］Li Y，Dai C，Wu C，et al.PINCH-1 promotes tubular epithelialto-mesenchymal transition by interacting with integrin-linked kinase［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(9):2534-2543.