食物源ACE抑制肽的生產及構效關系研究進展

王靈芝，張燕玲，王元明，喬延江*

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

食物源ACE抑制肽的生產及構效關系研究進展

王靈芝，張燕玲，王元明，喬延江*

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

生物活性肽是蛋白質中隱藏著的可在體內發揮一定生理功能的活性肽段。目前已從食物蛋白中獲得了具有免疫調節、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓形成、抗高血壓等功能的多肽，其中血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽是研究熱點之一。ACE通過產具有升壓作用的血管緊張素Ⅱ和降解擴張血管的舒緩激肽在調節血壓中發揮著重要作用。ACE抑制肽可通過消化道水解、發酵和熟化過程、體外酶解和遺傳重組方法而獲得，并可作為功能因子添加到功能食品中，相關產品已上市或研發中。本文對ACE抑制肽的生產及其構效關系研究進展等進行綜述。

生物活性肽；血管緊張素轉化酶(ACE)；高血壓

食物不僅在生長和維持機體時提供所必需的能量和物質基礎，而且與人體健康息息相關。近年來功能食品蓬勃興起，所謂功能食品是指通過提高機體健康狀態或者降低患病風險而有益健康的食品，它有別于藥物，是正常食物攝入的一部分[1]。食物蛋白經消化后可獲得有益健康的生物活性成分，因此，生物活性肽逐漸引起人們關注。這些活性肽由2～50個氨基酸組成，在食物蛋白中沒有活性，經體外酶水解或消化道酶水解后被釋放出來，發揮著不同的生理調節功能。同時，傳統的蛋白質消化、吸收理論暴露出一定的局限性，寡肽吸收理論逐漸被大眾接受，與游離氨基酸相比，寡肽吸收具有更快更高的速率和效率[2]。這些生物肽具有多種生物學活性，如抗氧化、抗血栓形成、抗高血壓、免疫調節、抗腫瘤、促進礦質元素吸收、阿片樣肽等[3-4]。近10年來這些降低慢性疾病危害、提高天然免疫力并存在于食品蛋白中的生物肽引起了學術界和商業界的極大興趣。

高血壓是危害人類健康的常見疾病之一，是心血管疾病的重要獨立危險因素。針對其高發性和危害性，改變生活方式、調整飲食結構和藥物治療是廣泛被接受的治療手段，其中營養因素在預防、治療高血壓中發揮著不可忽視的作用，因此，研發具有降壓作用的功能食品是科研工作者努力方向之一。血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)在血壓調節中發揮著重要作用，首先可作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin system，RAS)，將十肽的血管緊張素Ⅰ裂解成具有收縮血管作用的血管緊張素Ⅱ，同時能夠促進醛固酮分泌，導致水鈉滯留，血壓升高。其次，作用于激肽釋放酶-激肽系統(kallikrein kinin system，KKS)系統，使具有血管舒張作用的舒緩激肽轉變為沒有活力的緩釋肽，導致血壓進一步升高。動物和臨床實驗表明，生物活性肽通過抑制該酶活性產生了明顯的降壓效果。1979年，Oshima等[5]首次利用細菌膠原酶水解明膠獲得了6種活性較強的ACE抑制肽，此后從其他食品蛋白中分離的降血壓肽相繼出現，目前已從乳源蛋白質[4,6]、海洋生物[7-8]、蛋黃[9]、油菜籽[10]、鷹嘴豆[11]、蕎麥粉[12]、高梁[13]、小麥[14]、玉米[15-16]中獲得了食源性的ACE抑制肽。這些食品源降壓肽的降壓效果雖沒有臨床藥物好，但其副作用小，因而備受關注[17]。本文就近年來ACE抑制肽的生產加工、構效關系、作用機制等研究熱點進行綜述。

1 ACE抑制肽的制備

國內外生產生物活性肽常用的方法主要有酶解法、微生物發酵法、重組DNA法、化學合成法、酶合成法等[18-20]。

1.1 胃腸消化

膳食蛋白質和多肽被攝取后，在胃腸道中被各種酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶水解后，釋放不同長度的肽段。一部分肽可調節消化道酶活性、腸上皮細胞分泌炎性細胞因子、促進鈣離子吸收等方面直接發揮作用，其他肽則被吸收后經體循環到達靶器官或者組織而行使功能[21]。為深入了解消化道蛋白酶對膳食蛋白作用后產生ACE抑制肽的情況，可模擬胃腸道生理作用的條件對各種蛋白用消化酶進行處理。Jimenez-Escrig等[22]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解豆渣蛋白，獲得了ACE抑制肽和抗氧化肽。食品處理和加工方式可促進蛋白的消化和多肽釋放。高流體靜壓(200～400MPa)可加速胃蛋白酶水解卵清蛋白速率和提高血壓肽YAEERYPIL、FRADHPFL和RADHPFL的產量[23]。 與煮雞蛋相比煎蛋消化物表現出較高的ACE抑制活性，推測可能由于沸水加工過程使蛋白質變性程度較低，從而導致蛋白消化程度相對較低[24]。

1.2 發酵和熟化過程

微生物在生產發酵乳制品過程中會產生生物活性肽。文獻報道Lactobacillus helveticus、Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus、Lactococcus lactisssp.diacetylactis等多種菌可水解乳蛋白并釋放出ACE抑制肽，部分生物活性肽可使自發性高血壓大鼠(systolic blood pressure，SHR)收縮壓降低7.1～29.3mmHg，脫脂乳經發酵后可使中度高血壓患者血壓下降4.6～14.1mmHg[25]。研究較為清楚、已經進入商業化生產的降壓肽有VPP和IPP，如日本的Calpis公司生產的Ameal BP Peptide和芬蘭Valio公司生產的Valio Evolus Double Effects。

Pihlanto等[26]比較了牛乳經25株乳酸菌發酵后ACE體外活性，發現不同菌種間存在著差異，且與水解度存在相關性；同時采用RP-HPLC、MS和氨基酸測序方法獲得了Lactobacillus jensenii發酵產物中兩個ACE活性肽，即LVYPFPGPIHNSLPQN和LVYPFPGPIH。牛乳經Enterococcus faecalis發酵后可產生多種ACE抑制肽，其中五肽LHLPLP和十九肽LVYPFPGPIPNSLPQNIPP的IC50值分別為5.5、5.2μmol/L[27]。在發酵過程中鈣離子濃度變化對ACE活性存在一定影響[28]。

在干酪成熟過程中，多數乳蛋白在內源性蛋白酶、凝固劑和微生物酶的作用下被降解成大量的多肽。在干酪制作過程中尤其是熟處理會產生大量的ACE抑制肽，目前，已經從Gou..da等多種奶酪中獲得了氨基酸結構明確的降壓肽[29]。Butikofer等[30]于2007年采用液質聯用方法測定了44種傳統奶酪制品中降壓三肽VPP和IPP的含量分別在0～224mg/kg和0～95mg/kg之間，且奶酪水提物降壓活性與三肽含量存在相關性；但是品種間、同一品種不同樣品間三肽含量差異較大，因此應當采用高重復性的制備工藝以提高降壓肽含量。

東方傳統的大豆發酵食品是ACE降壓肽的另外一個重要來源。我國傳統調味品豆豉(埃及曲霉Aspergillus egyptiacus發酵)富含ACE抑制肽，發酵48h的豆豉曲及經胃蛋白酶單酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶解、水豆豉的IC50值分別為5.09、0.16、0.057、4.54mg/mL[31]。韓國傳統大豆發酵食品Doenjang、Cheonggukjang、Kochujang等含有大量的生物肽，其中分子質量小于3kD的ACE抑制肽的IC50值為0.5mg/mL，500～999D的IC50值為 0.094mg/mL[32]。

1.3 酶解法

酶解法是目前研究的最多的一種方法。有大量研究報道利用消化道源蛋白酶如：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等獲得各種功能生物肽。用胃蛋白酶水解牡蠣蛋白，然后采用Sephadex LH-20凝膠層析和RP-HPLC方法分離得到了一種降壓活性較好的九肽[33]。Contreras等[34]用胃蛋白酶等水解酪蛋白，獲得具有體內外降壓活性的生物活性肽RYLGY和AYFYPEL。與此同時，微生物和真菌來源的蛋白水解酶也可用來水解各種蛋白以制備生物活性肽，這些商業化生產的蛋白酶因其價格低、安全性好和產量高而倍受關注。Ueno等[35]從瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticusCM4中分離和純化到可產生降壓肽的內切酶，該酶在底物的C端處理中發揮重要作用。采用9種不同的商業化蛋白酶水解酪蛋白以獲得ACE抑制肽，發現曲霉菌Aspergillus oryzae來源的蛋白酶可高效釋放降壓三肽VPP和IPP[36]。

近年來，采用高壓、熱變性和功率超聲等技術改變蛋白結構以提高蛋白水解效率是另一研究熱點。與常壓條件下相比，高壓狀態(400MPa)胰蛋白酶水解蛋白發生了質和量的變化，其中疏水性肽增加[37]。Henandez-Ledesma等[38]用嗜熱菌蛋白酶水解乳球蛋白發現，水解溫度60～80℃與37℃和50℃相比，會產生新的生物活性肽LDA、LKPTPEGD和LQKW，其中四肽LQKW據文獻報道具有降壓活性。研究表明長時間高密度超聲產生的·OH和剪切力可降低α-淀粉酶活性，但是短暫的超聲處理可促進酶解。Jia Junqiang等[39]用堿性蛋白酶水解小麥胚蛋白制備ACE降壓肽，發現用超聲波處理的樣品與常規處理相比，其結合常數KA增加22.2%，米氏常數(Km)降低了13.0%，且ACE抑制活力增加21.0%～40.7%。

1.4 遺傳重組

基因工程技術的發展為降壓肽的開發利用帶來了新的契機。Liu Dong等[40]將降壓肽KVLPVP連接成六拷貝的串聯多肽，并利用基因工程手段克隆到大腸桿菌融合表達載體上，構建了重組降血壓肽基因工程菌，表達的融合蛋白GST-ACEIP經蛋白酶消化后獲得了體內外活性較高的重組降壓肽。由于釋放目標肽段時需要添加額外蛋白酶，因而增加了分離和純化的成本。Rao Shengqi等[41]成功表達了包含11種降壓肽的融合蛋白，經消化道酶消化后，多肽ACE抑制率達85%以上。

2 定量構效關系

近來，人工神經網絡和QSAR建模方法被用于基于結構-活性數據構建統計計算機模型，已識別出了影響食物源ACE抑制肽效能的部分結構特征。許多描述符已經被公認為QSAR模型中的關鍵變量，如分子質量、分子形狀、疏水性電荷和靜電特征[42]。大多數ACE抑制肽序列較短，一般為2～12個氨基酸；這與Natesh等[43]的結果一致，他們的晶體學研究證明ACE的活性位點不能容納大的多肽分子。構效關系研究表明，C末端三肽殘基在競爭性結合ACE活性位點中起關鍵作用。大多數有效的ACE抑制肽在C-端包含Tyr、Phe、Trp，以及可能含有Pro，而且Leu可能對增加多肽的ACE抑制潛力具有顯著作用。此外，其他支鏈脂肪族氨基酸在高抑制肽活性中占有主要地位，如Ile和Val。帶正電荷的Lys(ε-氨基)和Arg(胍基)作為C末端有助提高抑制活性。ACE抑制肽有不同于非活性肽的特征結構，如在C-末端有相似的正電位，在離C末端3個氨基酸位置上需要L-構型氨基酸等。此外，ACE抑制肽C端Pro的cis-trans構象的變化可能引起與酶相互作用的顯著變化。

3 結 語

在目前所發現的各種具有生物活性的多肽之中，具有抗高血壓活性的多肽備受關注，其抗高血壓的活性在包括體外實驗、動物模型和人體實驗中被檢測過，并且被添加于各種不同的食品中。然而，相互矛盾的臨床實驗結果和不同的健康法規使得這一領域的研究顯得更加迫切。此前的各類研究都證實了這類多肽的穩定性、可吸收性及其在生物體內的活性形態。隨著分析技術的發展，已經能夠在模型生物或者人體內的復雜基質或者生物體液中追蹤微量多肽及其衍生物并進行動力學分析。同樣，隨著營養基因學和營養遺傳學等新學科的發展，將能夠通過識別新的更加復雜的生物標記來研究生物體內的生物活性物質。

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A Review of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Peptides Derived from Foods: Production and Quantitative Structure-Activity Relationship

WANG Ling-zhi，ZHANG Yan-ling，WANG Yuan-ming，QIAO Yan-jiang*
( School of Chinese Material Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

Bioactive peptides are peptides with physiological functions in the body, such as immunomodulatory, antimicrobial,anticancer, antivirus, antithrombotic and antihypertension functions. Currently, peptides from foods with angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity are the focus of intense study. ACE plays a vital role in the regulation of blood pressure by producing potent vasoconstrictor angiotensine II, as well as by inactivating the vasodilating bradykinin. ACE inhibitory peptides have widely been produced by gastrointestinal digestion, fermentation and maturation process, enzymatic hydrolysis and genetic recombination. These inhibitory peptides may be incorporated into functional foods and several products are currently commercially available or under development. This paper presents an overview of antihypertensive peptides derived from food protein.

bioactive peptides；angiotensin converting enzyme (ACE)；hypertension

Q514.3

A

1002-6630(2012)15-0314-04

2011-10-26

國家自然科學基金項目(81102750)

王靈芝(1974—)，女，講師，博士，研究方向為生物制藥。E-mail：yanyan30186@sina.com.cn

*通信作者：喬延江(1956—)，男，教授，博士，研究方向為中藥信息工程、中藥信息開發。E-mail：yjqiao@263.net