茯苓總三萜對小鼠肝損傷的預防作用

張先淑，饒志剛，胡先明,*，劉 鵬

(1.重慶工貿職業技術學院，重慶 408000；2. 病毒學國家重點實驗室，組合生物合成與新藥發現教育部重點實驗室，武漢大學藥學院，湖北 武漢 430071)

茯苓總三萜對小鼠肝損傷的預防作用

張先淑1，饒志剛2，胡先明2,*，劉 鵬2

(1.重慶工貿職業技術學院，重慶 408000；2. 病毒學國家重點實驗室，組合生物合成與新藥發現教育部重點實驗室，武漢大學藥學院，湖北 武漢 430071)

目的：研究茯苓三萜對四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝損傷的治療作用。方法：將小鼠隨機分為正常組、模型組、聯苯雙酯組及茯苓三萜高、中、低劑量組共6組。小鼠腹腔注射CCl4橄欖油溶液造模。治療組以高、中、低劑量(180、90、45mg/(kg·d))茯苓三萜進行灌胃，陽性藥物對照組用聯苯雙酯滴丸(180mg/(kg·d))，皆以1g/100mL羧甲基纖維素鈉溶液混懸，0.2mL/10g體質量進行灌胃；正常組與模型組以0.9%生理鹽水(0.2mL/10g)體質量灌胃。最后摘眼球取血，收集血清，檢測丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)活性；以及小鼠肝組織HE染色后做病理切片觀察。結果：與模型組相比茯苓三萜治療組能夠顯著降低小鼠血清中AST、ALT活性。病理切片清楚地顯示茯苓三萜能夠顯著減輕小鼠肝損傷的程度。結論：茯苓三萜對CCl4所致的小鼠肝損傷有明顯治療作用。

茯苓三萜；小鼠；肝損傷；四氯化碳；治療作用

茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(schw.)wolf)的干燥菌核[1]。它為我國常用中藥，是多種方藥及中成藥的原料，以茯苓為原料配伍的中成藥有300 多種[2]。它具有利水消腫、滲濕、健脾、寧心的功效，其主要化學成分為多糖、三萜類化合物(茯苓酸、茯苓素)等。三萜類化合物具有免疫調節[3]、抗氧化[4]、抗炎癥[5]、抗腫瘤[6]等活性，國內外對茯苓三萜類成分及其生物活性等方面做了一些研究。但茯苓總三萜的保肝活性未見報道。據此，本實驗選用四氯化碳致小鼠肝損傷模型對茯苓總三萜的保肝作用做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種小鼠，雌性，體質量 25～28g；實驗動物由武漢大學動物實驗中心提供，S P F級，許可證號SCXK(鄂)2008-2004。自由飲水，攝食。

1.2 藥物與試劑

茯苓總三萜(溶劑法提取)、熊果酸標品(純度＞98%) 上海友思生物技術有限公司；聯苯雙酯滴丸(保肝藥物) 浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠；生理鹽水(0.9%)、CCl4(分析純) 江蘇強盛化工有限公司；羧甲基纖維素鈉(化學純)、橄欖油(化學純) 國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發儀 鄭州長城科工貿有限公司；722型可見分光光度計 廣州市科迅實驗器材有限公司；7170型全自動生化分析儀 珠海森龍生物科技有限公司；JA3103N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；16K臺式離心機 珠海黑馬醫學儀器有限公司；XSP-6CA光學顯微鏡 上海團結制造廠。

1.4 方法

1.4.1 茯苓總三萜提取[7]

稱取500g茯苓干燥藥材，粉碎，過20目篩，加藥材量6倍體積的95%乙醇浸泡 48h后過濾，回收乙醇，所得黑褐色浸膏懸浮于水中，用 250mL 乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得棕黃色濃縮液。

1.4.2 總三萜定性鑒定[7]

取20mg 總三萜溶于5mL醋酐中，加濃硫酸-醋酐(體積比1:20)5mL，觀察溶液顏色變化。

1.4.3 總三萜含量測定[8]

以熊果酸為標準品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色法，參照文獻[10]用分光光度法，按照公式(1)計算出茯苓總三萜的含量。

式中：ρ為樣品液中三萜質量濃度/(g/L)；V為樣品液體積/L；m為樣品質量/g。

1.4.4 CCl4致小鼠肝損傷的治療作用[9]

昆明種小鼠7 2只，雌性，隨機均分為6組，每組12只。分別為茯苓三萜高、中、低劑量組，模型對照組、正常組和聯苯雙酯組。實驗前稱小鼠體質量，給藥組及對照組皆從實驗第1天起，每天上午腹腔注射0.2% CCl4橄欖油溶液0.1mL/10g。同日下午，給藥組以高、中、低劑量分別為180、90、45mg/(kg·d)的茯苓三萜，用1g/100mL羧甲基纖維素鈉混懸( 0.2 mL/10g體質量)灌胃；聯苯雙酯組以聯苯雙酯180mg/(kg·d)劑量，用1g/100mL羧甲基纖維素鈉混懸灌胃，0.2mL/10g體質量；正常組與模型對照組均灌服0.9%的生理鹽水，0.2mL/10g體質量。第2～4天每天上午給藥同上，第4天下午再重復注射CCl41次，最后一次處理完后，所有組的小鼠都禁食不禁水。第5天上午稱小鼠體質量后摘眼球取血，分離血清，用自動生化分析儀測定ALT與AST。處死動物，剖腹取肝臟與脾臟，分別稱質量后，計算臟器指數；然后取肝右葉，固定于10%中性甲醛液中，常規石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學改變。

1.4.5 觀察指標及其方法

1.4.5.1 血清中生化指標的測定

用7170型全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

1.4.5.2 肝臟指數與脾臟指數的測定

處死動物，剖腹取肝臟與脾臟，分別稱質量，肝臟指數(肝體比)與脾臟指數(脾體比)的測定分別按照公式(2)、(3)計算。

式中：m1為肝濕質量/g；m為體質量/g；m2為脾濕質量/g。

1.4.5.3 肝臟組織形態學觀察

取肝右葉組織置于10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋，切片，作HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織形態學變化情況。

1.4.6 統計學處理

2 結果與分析

2.1 茯苓總三萜定性分析與含量測定

2.1.1 總三萜定性鑒定

取20mg 總三萜溶于 5mL 醋酐中，加濃硫酸-醋酐(體積比 1:20) 5mL，溶液由黃變紅，逐漸變紫變藍，最后褪色。證明提取物中含有三萜類。

表2 小鼠體質量與肝臟及脾臟質量(±s，n=12)Table 2 Body, liver and speen weights of mice in each group(±s，n=12)

表2 小鼠體質量與肝臟及脾臟質量(±s，n=12)Table 2 Body, liver and speen weights of mice in each group(±s，n=12)

注：a.與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)；b. 與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)。

組別 實驗前體質量/g 實驗后體質量/g 肝臟質量/g 脾臟質量/g 肝臟指數 脾臟指數正常組 27.85±9.14 28.17±21.82 1.11±0.04a 0.071±3.25×10-5 3.961±0.3341b 0.2552±0.001379模型組 27.59±9.87 27.77±25.27 1.63±0.28 0.077±0.00035 5.756±1.070 0.2744±0.0008910聯苯雙酯組 27.32±10.32 27.33±14.00 1.53±0.07 0.077±0.00035 5.646±0.7525 0.2586±0.006147低劑量組 25.28±14.81 26.02±20.33 1.48±0.27 0.073±0.00015 5.576±1.515 0.2810±0.0004020中劑量組 27.50±5.41 27.58±11.14 1.44±0.07 0.070±2.45×10-5 5.189±0.2665 0.2566±0.0009330高劑量組 27.54±4.77 28.04±8.93 1.46±0.08 0.070±0.00019 5.165±0.3689 0.2494±0.002025

2.1.2 總三萜含量測定

由標準曲線可得回歸方程為y＝0.08390.0902(R2＝0.9993)，其中，x為樣品中茯苓總三萜含量/(mg/mL)，y為吸光度。經實驗測得樣品液的吸光度為0.337。由上述回歸方程計算得樣品液中三萜含量為2.56mg/mL；三萜的百分含量為1.27%。

2.2 血清學檢測

表1 茯苓三萜對小鼠血清ALT與AST活性的影響(±s，n=12)Table 1 Effect of Poria cocos triterpenes on serum ALT and AST in mice(±s，n=12)

表1 茯苓三萜對小鼠血清ALT與AST活性的影響(±s，n=12)Table 1 Effect of Poria cocos triterpenes on serum ALT and AST in mice(±s，n=12)

注：a.與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)；b.與正常組相比，差異極顯著(P＜0.01)。

組別 AST活力/( U/mL) ALT活力/( U/mL)正常組 44.00±24.96 32.22±3.95模型組 139.33±8.21b 286.56±12.15b聯苯雙酯組 84.00±8.50a 188.67±26.75a低劑量組 123.56±7.09a 258.00±13.40a中劑量組 116.11±9.16a 216.11±9.57a高劑量組 88.78±5.70a 207.22±21.69a

由表1可知，模型組小鼠血清AST、ALT活力較正常組明顯升高(P＜0.01)，茯苓三萜各治療組AST、ALT活力明顯低于模型組(P＜0.01)，且各劑量組之間存在量效關系。

2.3 CCl4致小鼠肝損傷的臟器指數

由表2可知，正常組肝臟質量與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，說明CCl4會使小鼠肝臟明顯腫大；茯苓三萜低、中、高劑量組與模型組比較，能降低肝臟質量，但差異不顯著(P＞0.05)，無統計學意義。正常組肝臟指數與模型組比較，差異極顯著(P＜0.01)，說明CCl4會使小鼠肝臟指數增大；茯苓三萜低、中、高劑量組與模型組比較，能降低肝臟質量指數，但差異不顯著(P＞0.05)，無統計學意義。

正常組脾臟質量與模型組比較，CCl4會使小鼠脾臟腫大，但差異不顯著(P＞0.05)，無統計學意義；茯苓三萜低、中、高劑量組與模型組比較，能降低脾臟質量，但差異不顯著(P＞0.05)，無統計學意義。正常組脾臟指數與模型組比較，CCl4會使小鼠脾臟指數增大，但差異不顯著(P＞0.05)，無統計學意義；茯苓三萜中、高劑量組與模型組比較，能降低脾臟指數，但差異不顯著(P＞0.05)，無統計學意義。

由此說明CCl4會使小鼠肝臟和脾臟腫大，使肝臟和脾臟指數增大；而茯苓三萜能適當抑制CCl4所致的小鼠肝臟和脾臟腫大。

2.4 肝組織病理切片

圖1 肝臟病理切片(×100)Fig.1 Pathological analysis of liver tissues by HE staining (×100)

由圖1可知，模型組小鼠肝組織鏡下可見肝小葉結構稍紊亂，肝小葉內肝細胞大部分腫脹，細胞質疏松，部分肝細胞氣球樣變，脂肪變性，匯管區少許炎癥細胞浸潤，無明顯壞死。對于CCl4引起的肝臟組織病理病變，茯苓三萜低、中、高劑量組能減輕肝細胞腫脹，對CCl4引起的急性肝損傷有明顯的保護作用。其中茯苓三萜低劑量組使肝小葉結構有所改善，但纖維化、脂肪變性仍明顯；茯苓三萜中劑量組使纖維化改善，脂肪變性仍較明顯，膠原纖維間隔較少；茯苓三萜高劑量組使輕度脂肪變性且僅有少量纖維組織，小葉結構明顯改善，肝小葉多呈放射狀分布，匯管區結締組織增生不明顯；聯苯雙酯陽性對照組使細胞腫脹、氣球樣變、肝竇充血明顯減輕。而正常組則肝組織結構正常，無脂滴、腫脹、炎癥細胞浸潤。

3 討 論

運用經典的CCl4模型，同時以低、中、高劑量茯苓三萜給予治療，通過血清學指標檢測，結果發現茯苓三萜能夠有效降低上述指標，表明其對受損肝臟有保護作用；另外從肝組織病理切片發現治療組的肝纖維化病變得到改善，并且呈現劑量相關性。這為茯苓作為保肝功能的保健食品開發提供了前景。當然，已有研究[10-12]顯示MMP-2是肝臟最重要的病變因子，可能參與了肝細胞變形的發生、發展。本實驗只探討了茯苓三萜抗肝損傷的作用，而它的作用機制還需通過TGF-β1mRNA及MMP-2等的表達做進一步研究。

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Preventive Effect of Triterpenes fromPoria cocoson Liver Injury in Mice

ZHANG Xian-shu1，RAO Zhi-gang2，HU Xian-ming2,*，LIU Peng2
(1. Chongqing Industry and Trade Polylechnic, Chongqing 408000, China；2. State Key Laboratory of Virology, Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery,Ministry of Education; School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071, China)

Objective ：To explore the preventive effect of triterpenes fromPoria cocoson carbon tetrachloride-induced liver injury in mice. Methods: Kunming mice were randomly divided into normal group, model group, (dimethyl diphenyl bicarboxylate,DDB) positive control group, and low-, middle- and high-dose treatment groups. Mouse models of liver injury were created by intraperitoneal injection of CCl4. The high-, middle- and low-dose treatment groups were orally administered with triterpenes fromPoria cocosat doses of 180, 90 mg/(kg· d) and 45 mg/(kg·d), respectively. The positive control group was orally administered with DDB at a dose of 180 mg/(kg·d). Both drugs were separately suspended in 1 g/100 mL CMC-Na solution before administration and given at a level of 0.2 mL/10 g body weight. The normal and model groups were given 0.9% normal saline at a level of 0.2 mL/10 g body weight. The serum AST and ALT activities were determined and liver injury was evaluated by HE staining. Results: Compared with the model group, the three treatment groups showed significantly lower AST and ALT activities. In addition,Poria cocostriterpenes could significantly attenuate liver injury in mice. Conclusion:Poriacocostriterpenes have obvious protective effect on CCl4-induced liver injury in mice.

Poria cocostriterpenes；mice；liver injury；carbon tetrachloride；treatment efficacy

TS201.21

A

1002-6630(2012)15-0270-04

2011-07-06

國家科技部重大專項(2009ZX09301-14-1)

張先淑(1972—)，女，講師，本科，研究方向為生物化學與天然藥物學。E-mail：czqpeng@126.com

*通信作者：胡先明(1951—)，男，教授，博士，研究方向為藥物化學與保健食品。E-mail：xmhu@whu.edu.cn