響應面法優化短短芽孢桿菌F M4 B的發酵培養基

芮廣虎，胡雪芹*，殷 坤，張洪斌

(合肥工業大學醫學工程學院，安徽 合肥 230009)

響應面法優化短短芽孢桿菌F M4 B的發酵培養基

芮廣虎，胡雪芹*，殷 坤，張洪斌

(合肥工業大學醫學工程學院，安徽 合肥 230009)

采用Plackett-Burman法考察發酵培養基中各組分對抗真菌活性物質產量的影響。結果表明：葡萄糖、蔗糖、K2HPO4的質量濃度對抗真菌活性物質產量影響顯著。再采用最陡爬坡路徑逼近最大響應區域，并結合Box-Behnken響應面法對3個主要因素進行分析，得到優化的發酵培養基組成(g/L)：葡萄糖6.1、蔗糖31.3、蛋白胨23.1、K2HPO4 0.825、MgSO4·7H2O 0.5。采用該法優化所得的培養基，其抑菌圈面積增加了42%。

短短芽孢桿菌；生物防治；Box-Behnken試驗；響應曲面法；培養基優化

近年來，食品安全得到了人們的普遍關注。由食品安全引發的問題，已成為人類健康的主要影響因素，各國政府紛紛將保證和提高食品安全視為提高人民生活質量、保持社會穩定和經濟發展的重大戰略問題[1]。然而，人均耕地面積日漸減少，要求提高單位面積作物產量，最大程度地減少病蟲害，導致大量使用化學農藥對農作物進行保護。化學農藥的廣泛使用，污染和破壞了生態環境，帶來了嚴重的后果，食品中殘留農藥的毒害事故頻頻發生。因此，控制與消除化學農藥污染，開發與環境和諧的生物防治方法，已成為環境保護的一個熱點問題。

農作物的枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的土傳真菌性病害，難防難治。國內外已有大量生物防治農作物病蟲害的相關報道。據報道[2-5]，芽孢桿菌(Bacillusspp.)是一類在自然界中廣泛存在的微生物，可產生抗生素、細菌素、抗菌蛋白等多種抗菌物質。這類細菌多為革蘭氏陽性菌，可以形成芽孢，細胞壁不含內毒素，對人畜無害[6]，是非常有價值的生防菌。

本實驗室從西瓜植株根際周圍篩選到一株拮抗菌FM4B，經鑒定為短短芽孢桿菌，離體條件下，其發酵液對多種枯萎病病菌的生長有很強的抑制作用，前期實驗表明該菌及發酵液能降低西瓜枯萎病發病率，并能促進西瓜植株的生長[7]。因此，具有很好的研究價值及開發前景。為了提高抗枯萎病菌活性物質產量，本實驗采用響應面法對發酵培養基進行優化，可以快速地從眾多的試驗因素中挑選出影響顯著的因素，對顯著因素做進一步的優化，得出最優的培養基組成。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試生防菌為短短芽孢桿菌Brevibacillus brevisFM4B菌株，由本實驗室提供；活性指示菌為西瓜枯萎病菌Fusariurn oxysporumf.sp.niveum，由上海交通大學提供。

1.2 儀器與設備

SL202N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市晶玻實驗儀器廠；KQ-500型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HQ45B型恒溫搖床 中國科學院武漢科學儀器廠；SPX-150B型生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 培養基與培養條件

PDA培養基(g/L)：葡萄糖20、土豆200、瓊脂18，pH值自然。斜面培養基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂18，pH7.0，28℃培養24h。種子培養基和發酵培養基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨23.1、K2HPO40.1、MgSO4·7H2O 0.5，pH7.5。

培養條件：從斜面上挑取3環接種到含50mL種子培養基的250mL錐形瓶里，30℃、200r/min培養15h，得種子液。按5%的接種量接種到裝有50mL發酵培養基的250mL錐形瓶中，28℃、180r/min培養21h，離心除菌體，得活性物質發酵液。

1.4 抗真菌活性的測定方法

抗真菌活性的測定采用杯碟法，以沒有指示菌生長的區域面積來表示抗菌活力。300μL指示菌孢子懸液(105CFU/mL)與50℃的20mL PDA培養基混合搖勻后倒平板。在凝固的平板上打孔(直徑6mm)，每孔中加入活性物質發酵液100μL，28℃培養48h，觀察并計算抑菌圈面積。

1.5 方法

1.5.1 Plackett-Burman試驗設計

根據預實驗研究的結果[8]， FM4B菌株的發酵培養基成分主要有：葡萄糖、FeSO4·7H2O、蔗糖、黃豆餅粉、蛋白胨、NH4NO3、酵母膏、K2HPO4和MgSO4·7H2O。采用Plackett-Burman試驗設計[9-10]，見表1，擬合方程為：Y＝γ0＋γ1X1＋γ2X2＋γ3X3＋γ4X4＋γ5X5＋γ6X6＋γ7X7＋γ8X8＋γ9X9

表1 Plackett-Burman試驗分析因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.5.2 最陡爬坡試驗設計

對Plackett-Burman試驗的因素作顯著性分析，找出主要因素。根據擬合函數回歸系數的符號和大小來設計主要因素的最陡上升路徑，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。試驗組數由經驗來定，步長由主要因素的效應值確定。通過使主要因素同時朝響應值增大的方向變化，找出峰值，從而逼近最大的響應區域[11-12]。

1.5.3 Box-Behnken試驗設計[11]

根據1.5.1、1.5.2節的實驗結果，用SAS (Version8.1)進行響應面試驗設計并對試驗數據進行回歸性分析，用t檢驗驗證回歸系數的顯著性，用F檢驗評價模型方程的顯著性，方程的擬合性由R2確定。

1.6 模型驗證

用SAS(Version8.1)對多元函數進行擬合和方差分析。對自變量求偏導數，可確定出其極值點[10]。再按照計算所得到的參數進行驗證實驗，以檢驗模型的重復性和可靠性。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗對主要因素的篩選

采用Plackett-Burman法，對9個組分進行考察。每個組分取高水平(＋1)和低水平(－1)，見表2。各組分所代表的高低水平和方差分析結果，見表3。

表2 Placket-Burman設計與響應值Table2 Placket-Burman design and corresponding results

表3 各因素影響的主效應分析Table 3 Main effects analysis of medium components

由表3可知，培養基組分對活性物質產量的影響顯著性[13]的排序為：葡萄糖＞蔗糖＞K2HPO4＞FeSO4·7 H2O＞黃豆餅粉＞酵母膏＞蛋白胨＞N H4N O3＞MgSO4·7H2O。顯然，葡萄糖、蔗糖和K2HPO4的影響較為突出，葡萄糖對于菌體產抑菌物質呈現負效應，蔗糖和K2HPO4呈正效應。這些效應關系用方程式表示為：Y＝337.1667－62.5X1＋53.83333X3＋40.83333X8，方程R2＝0.9618，表明該回歸方程擬合良好。從方程中還可以看出，要提高產量，應適當降低葡萄糖質量濃度，提高蔗糖和K2HPO4質量濃度。

2.2 最陡爬坡試驗研究最大響應值的響應區域

根據Plackett-Burman試驗設計法篩選出的主要組分的效應大小設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗設計，尋找最大產量區。試驗設計及結果如表4所示。最大產量區在試驗號2附近。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Steepest ascent procedure and corresponding results

2.3 Box-Behnken試驗優化培養基成分

表5 響應面分析試驗因素水平表Table 5 Factors and levels of response surface analysis

根據最陡爬坡試驗結果，以試驗號2的條件為響應面試驗因素水平的中心點。響應面試驗因素水平設計見表5。采用Box-Behnken響應面試驗設計確定主要因素的最優水平，試驗設計及結果見表6。SAS(Version8.1)擬合出的回歸方程模型為：Y＝395.3333－19.75x1＋7.75x2－11x3－13.16667x12－4.5x1x3＋12.16667x22＋8.5x2x3－9.166667x32。回歸方程的方差分析見表7。

表6 Box-Behnken響應面設計和對應結果Table 6 Box-Behnken design and corresponding response values

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for the proposed quadratic polynomial model

方程自變量平方項的符號皆為負值，則拋物線的開口向下，所以有對應的極大值點[10]。由方差分析得出大于F值的概率為0.003877，表明回歸方程模型的顯著性及可靠性很好；而且方程R2＝0.9651，表明了響應模型可以解釋96.51%的總體變異情況，只有3.49%的變異無法用模型來解釋[14-16]，回歸模型有高度的相關性[17]。這個模型可以用于活性物質產量的分析和預測。聯合響應面回歸分析和回歸方程繪制的響應面圖形如圖1～3所示。

圖1 x1與x2交互作用對Y值預測響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot of Y versus x1 and x2

圖2 x2與x3交互作用對Y值預測響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot of Y versus x2 and x3

圖3 x1與x3對Y值預測響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of Y versus x1 and x3

通過觀察上述圖形的變化趨勢得出：x1、x2、x3在試驗范圍內存在極大值點。這3個組分的最優試驗點(x1,x2,x3)為(0.917, 0.500, 0.000)，即葡萄糖6.1g/L、蔗糖31.3g/L、K2HPO40.825g/L，在此點預測的抑菌圈面積為403mm2；x1x2交互作用的等高線近似圓形，則兩者的交互作用不顯著；x2x3和x1x3交互作用的等高線都是橢圓，則兩元素間的交互作用顯著[18]。

2.4 驗證實驗

為了檢驗模型預測的準確性，在優化條件下進行3組裝液量為50mL/250mL的發酵實驗，所測的抑菌圈面積都在400mm2以上，平均值為405mm2。與模型預測值非常接近，表明設計模型能很好的預測實際的發酵情況。

3 結 論

SAS全稱為Satistics Aalysis System，它是包括數據的統計分析、運籌等為題的科學計算等大量模塊的集成軟件系統。Plackett-Burman試驗設計法的優越之處在于試驗次數少，周期短，精度高[19]，從眾多的考察因素中挑選出影響試驗的幾個主要因素，以供進一步的深入研究[20]。響應面法可以對影響生物產量的主要因素的含量和它們間的交互作用進行優化和評價，確定出多因素體系的最優解。

本研究通過采用Plackett-Burman試驗設計，對影響菌株FM4B代謝產生抗菌活性物質的9個組分進行了評價和分析，篩選出葡萄糖、蔗糖、K2HPO4為影響產量的主要因素。然后根據Box-Behnken響應面試驗設計原理，確定了培養基的最優組分為(g/L)：葡萄糖6.1、蔗糖31.3、蛋白胨23.1、K2HPO40.825、MgSO4·7H2O 0.5。發酵液的抑菌圈面積由原來的285mm2提高到405mm2，增加了42%，進一步提高了FM4B菌株的抑菌活性。

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Medium Optimization for Antifungal Substance Production byBrevibacillus brevisFM4B Using Response Surface Methodology

RUI Guang-hu，HU Xue-qin*，YIN Kun，ZHANG Hong-bin
(School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of 9 medium components on the production of antifungal substance byBrevibacillus brevisFM4B. The results showed that glucose, peptone and K2HPO4 were the most important medium components. Steepest ascent procedure and response surface methodology based on Box-Behnken experimental design were employed to optimize the three medium components. The optimal fermentation medium for producing antifungal substance was composed of glucose 6.1 g/L, peptone 23.1 g/L, sucrose 31.3 g/L, K2HPO4 0.825 g/L and MgSO4·7H2O 0.5 g/L. The inhibition spot area of the optimized culture medium after fermentation withBrevibacillus brevisFM4B was increased by 42% compared to that of the original medium.

Brevibacillus brevis；biological control；central composite design；response surface methodology；medium optimization

S432.4

A

1002-6630(2012)15-0257-05

2011-06-16

合肥工業大學大學生創新性實驗計劃項目(2010052)

芮廣虎(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為生物制藥工程。E-mail：ruiguanghu2008@163.com

*通信作者：胡雪芹(1976—)，女，副教授，研究方向為微生物制藥。E-mail：huxueqin12345@163.com