彩色馬鈴薯花色苷生物合成相關基因的研究進展

張新永，郭華春，趙昶靈

（云南農業大學薯類作物研究所，云南 昆明 650201）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是僅次于小麥、水稻和玉米的世界第四大糧食作物[1-2]，明朝中后期傳入我國，復雜氣候和生態條件使馬鈴薯分化出諸多品系，出現相當數量的彩色馬鈴薯，使我國的馬鈴薯種質資源庫更加豐富[3-5]。彩色馬鈴薯塊莖的顏色主要是由于其周皮和皮層存在花色苷的結果，花色苷是植物次生代謝過程中產生的黃酮類物質[6-7]，對于植物自身而言，花色苷類物質能夠顯著提高其抗UVB輻射、抗寒、抗旱、抗氧化等方面的能力[8-9]；對人類而言，花色苷具有抗氧化活性、抗衰老、防止血管硬化的功能，還是一種潛在的抗癌化合物，可作為食品、藥品和化妝品的天然色素[10-12]，因此，利用傳統雜交技術和分子育種技術培育彩色馬鈴薯新品種的研究逐漸受到重視[13-17]。

1 馬鈴薯塊莖花色苷生物合成途徑的研究現狀

花色苷由“一般苯丙烷類途徑”合成[18-20]（圖1），合成過程需要數種酶基因的參與才能夠完成，經過研究已經探明的有苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）、類黃酮-3′-羥化酶基因（F3′H）和類黃酮-3′,5′-羥化酶基因（F3′5′H）、花色素合成酶基因（ANS）、查耳酮合酶基因（CHS）、黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）、二氫黃酮醇-4-還原酶基因（DFR）和UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-糖基轉移酶基因（3GT）等多種酶基因[21-25]。

圖1 花色苷生物合成途徑Figure 1 The way of anthocyanin biosynthesis

絕大部分彩色馬鈴薯塊莖的皮色和肉色是紅色或者紫色。Howard等[26]發現馬鈴薯塊莖的粉紅和紫色分別來自天竺葵素和矮牽牛素的糖苷衍生物。20世紀90年代末，多名研究人員的生物化學分析結果表明：馬鈴薯塊莖皮和肉的紫色素在根本上是源于矮牽牛素[27-29]。有研究人員認為，從分子結構分析，矮牽牛素的生物合成應該有2種可能：（1）由花青素（即矢車菊素）經過甲氧基取代而成；（2）由飛燕草素（即花翠素、翠雀素）經過甲基取代而成[18]。因此，矮牽牛素生物合成的前提是：花青素或飛燕草素的合成。花青素合成的關鍵酶是類黃酮-3′-羥化酶（F3′H），飛燕草素合成的關鍵酶是類黃酮-3′,5′-羥化酶（F3′5′H），所以，有研究人員認為紫色馬鈴薯塊莖花色苷生物合成關鍵酶基因為：類黃酮-3′-羥化酶基因和類黃酮-3′，5′-羥化酶基因。

2 國外馬鈴薯塊莖花色苷生物合成相關基因的研究現狀

2.1 研究理論和相關基因的分子標記與功能

國外于花色素苷的合成代謝以及與之相關的基因研究開展地比較早，也比較深入。對花色苷生物合成的遺傳學研究起始于孟德爾的豌豆花色遺傳研究，早期是將基因位點與易于觀察的色彩變異聯系起來研究的。20世紀80年代末至90年代初，植物花色苷代謝途徑的研究已較為成熟，有些研究人員把影響花色苷代謝的基因分為結構基因和調節基因兩類，結構基因直接編碼花色苷代謝生物合成的酶類，調節基因控制結構基因的表達強度和表達方式[30-31]。

花色素苷在發育過程中的合成主要通過合成的酶在量上的增加實現的，而這些合成酶量的增加則由于這些酶基因轉錄的增加所致，目前已發現不少調控花色苷生物合成途徑調控基因，并用轉座子標簽等方法克隆了部分基因[32-33]。

國外對馬鈴薯花色苷生物合成相關基因的研究以馬鈴薯的二倍體材料開始。認為馬鈴薯花色苷的合成由3個基因控制：P控制著花和塊莖中花翠素的產生，R控制著塊莖中酰化花葵素苷的產生和花中花青素苷的產生，二者都決定花色苷的類型；Ac則控制著所有花色苷的酰化、葡萄糖殘基在苷元5位的連接和花翠素、花青素衍生物的甲基化[34-35]。但是，De Jong[22]認為：①馬鈴薯二倍體和四倍體栽培種塊莖紅、紫、白的變異由R、P和I這3個獨立的基因座控制；②R和P分別負責馬鈴薯塊莖、花、芽和莖中紅、紫色花色苷色素的產生，而且P對于R具有上位性[34]，I卻是花色苷在塊莖皮中的組織專一性表達所必需的[34,36]；③基因型為I-Rr-Pp或 Ii-rr-P的塊莖具有紫皮，而基因型為I-R-pp具有紅皮；④在I缺乏功能等位基因的馬鈴薯產生白色塊莖[22]。R、P和I分別定位于第 2、11、10號染色體上[37-38]。此后，De Jong的觀點長期統治馬鈴薯色素合成相關基因的研究。

2.2 花色苷生物合成結構基因的克隆與功能

Jeon等[39]克隆到馬鈴薯查耳酮合酶基因（CHS）家族兩個成員的cDNA序列；De Jong等[23]以番茄DFR基因為探針，通過掃描由馬鈴薯的花和莖構建的cDNA文庫，克隆到二氫黃酮醇4-還原酶基因（DFR）全長cDNA及其基因序列，進一步進行RFLP分析、PCR分析和共分離分析，驗證了它的功能，他們認為R編碼二氫黃酮醇-4-還原酶，一個DFR的等位基因關系到馬鈴薯產生紅色花色苷的能力。De Jong系統分析了R、P和I的具體功能：R是產生磚紅色天竺葵素類色素所必需的，似乎對應二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）；P是產生紫色飛燕草素（即花翠素、翠雀素）類色素所必需的，似乎對應類黃酮-3′5′-羥化酶（F3′5′H）；I是紅或紫色花色苷在塊莖皮中的組織專一性表達所必需的，似乎對應于矮牽牛Myb型結構域轉錄調節基因（AN2）[24,40]。Jung等[41]以矮牽牛類黃酮-3′5′-羥化酶基因（F3′5′H）基因為探針，通過掃描馬鈴薯的花和莖構建了cDNA文庫，獲得了馬鈴薯F3′5′H基因全長cDNA及其基因序列。Keifenheim等[42]克隆到馬鈴薯無色花色素加雙氧酶基因（LDOX）和類黃酮3-O-糖基轉移酶基因（3GT）的cDNA序列。

花色苷生物合成調節基因的研究也取得了較多的成果，研究人員分別從玉米（Zea mays）、矮牽牛（Petunia hybride）、紫蘇（Perilla frutescens）克隆到an1，an2，an4，myb-p1等20多個調節基因，但是沒有涉及馬鈴薯研究成果的報道。

2.3 相關基因啟動子的研究

國外對馬鈴薯花色苷生物合成相關基因啟動子的研究首先從糖基轉移酶基因（GT）的開始。Rorat等[43]經過 cDNA文庫差異篩選獲得馬鈴薯（S. sogarandinum）糖基轉移酶的啟動子，而他這樣研究是因為糖基轉移酶與馬鈴薯抗低溫、紫外線等脅迫相關。Korobczak等[44]進一步檢測了該啟動子的環境因子誘導表達特征，發現它可被紫外線、低溫、光、鹽和脫落酸誘導，低溫與光、脫落酸與低溫對該啟動子的誘導存在增效作用，而培養基中的蔗糖濃度高于2%時卻抑制該啟動子活性,該啟動子的細胞專一性主要體現為在葉片表皮和葉肉中高效表達，特別是在紫外線處理的情況下，它在莖組織中無活性，在塊莖中只在周皮內的皮層中和維管束環中表達、在根中僅表達于根毛區[45]。

3 國內對馬鈴薯花色苷生物合成相關基因的研究處于起步階段

2006年，南京農業大學的Lu和Yang[25]通過簡并引物從馬鈴薯野生種和栽培種中相繼完成馬鈴薯4個花色苷合成相關基因的cDNA克隆：查耳酮合酶基因、黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）、二氫黃酮醇4-還原酶基因和UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-糖基轉移酶基因（3GT），并對其功能進行了初步驗證，同時研究發現這4個基因在花、匍匐枝和頂芽中優先表達，在根中僅UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-糖基轉移酶基因表達，在塊莖皮中4個基因均被白光誘導表達。

4 研究展望

花色苷在本質上屬于類黃酮，植物莖葉細胞中如果含有較多的花色苷，將會顯著提高其抵抗UVB輻射、低溫等不利環境條件的影響[45]。云貴高原是中國馬鈴薯的主產區之一，隨著全球環境惡化，大氣臭氧空洞的擴大，地球特別是高海拔地區受到的紫外輻射越來越強，這勢必影響到高寒地區栽培的馬鈴薯等作物的生長，因此培育花色苷含量高以適應高寒冷涼地區生態環境的馬鈴薯新品種以保證云貴高原地區馬鈴薯產業的可持續發展也有重要意義。

云南具有獨特的立體氣候，其氣候特征與馬鈴薯起源地-南美洲安第斯山區尤為相似，復雜氣候和生態條件使馬鈴薯分化出很多品系，在云南各地出現了許多彩色馬鈴薯地方品種，使云南的馬鈴薯種質資源尤其豐富，如：蘭坪紫心、轉心烏、劍川紅、羅統紫芋、鐵廠紅、鶴慶紅等，為彩色馬鈴薯的研究利用提供了豐富的資源材料，這些農家品種雖然具有許多缺點，但塊莖對光不敏感，不易變綠，塊莖內不易形成對人體有害的龍葵素，耐貯藏且食味很好[4]。隨著社會發展和生活水平的提高，彩色馬鈴薯開始逐漸為人們所認識，彩色馬鈴薯成為功能食品也會逐漸被人們所接受，培育彩色馬鈴薯新品種，也將成為發展馬鈴薯產業的趨勢之一。

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